1.ra parte — Comparación de líneas celulares humanas iPS con el sistema de monitorización de incubación CM20: Observación en el contexto de diferenciación de orgánulos de hígado derivados de células iPS

Introducción

Las células madre pluripotentes inducidas (iPS) son usadas con bastante frecuencia en investigaciones básicas de embriología, como la diferenciación celular y la formación de órganos, pasando por la investigación asociada al descubrimiento de fármacos y desarrollo de métodos de diagnóstico para enfermedades. Hasta la fecha, se han definido muchas líneas celulares de iPS en todo el mundo, pero sus propiedades —como el potencial de diferenciación y la velocidad de crecimiento— difieren entre las distintas cepas. Si bien estas diferencias son conocidas, nunca han sido cuantificadas usando células cultivadas bajo las mismas condiciones ambientales. Esto hace que sea difícil determinar si dichas variaciones están asociadas a diferencias en el entorno, procedimientos entre los laboratorios, o bien si son inherentes a las propias líneas celulares. Aunque existen variaciones en las propiedades de las células diferenciadas que derivan de células iPS, estas no se descubren hasta completar el cultivo, de modo que las células inducidas en el contexto de la diferenciación pueden presentar anomalías. Basados en esta premisa, es importante contar con una herramienta que permita inspeccionar las células iPS a largo plazo, llevar un control de calidad eficiente y administrar los datos del proceso de forma apropiada hasta el experimento de inducción de la diferenciación.

Análisis de datos cuantitativos de cultivo celular usando el sistema de monitorización de incubación CM20

Mediante las mediciones cuantitativas que proporciona el sistema de monitorización de incubación CM20 de Olympus, se analizaron los puntos de control de las variaciones en la creación de orgánulos por parte de las células iPS y se determinó un método para analizar el antecedente del genoma de la enfermedad en función de una comparación de varias muestras. Para este estudio, se cultivaron 12 cepas humanas de células iPS, provenientes de distintos donantes, usando el mismo proceso; y, los datos sobre el proceso de crecimiento de cada línea celular se obtuvieron usando el sistema de monitorización de incubación CM20 de Olympus.

Protocolo de cultivo

El mantenimiento de los cultivos de células humanas iPS se ejecutó en una placa de seis pocillos sin alimentador aplicando el medio de cultivo StemFit AK02N (Ajinomoto Co., Inc.) y una matriz con revestimiento de placa iMarix-511 (Matrixome Inc.). Se procedió al subcultivo usado la unicelularización con una solución de Accutase extraíble y distribución de 1,0–2,0 × 104 células/pocillo, y se cultivaron en el medio de cultivo StemFit AK02N complementado con Y-27632 durante 24 horas. Posteriormente, las células humanas iPS proliferaron debido al intercambio con el medio de cultivo StemFit AK02N sin complemento Y-27632 y se cultivaron durante 1 semana a través un cambio del medio de cultivo cada dos días (Fig. 1).

Figura 1. Cómo se cultivan las células humanas de iPS

Imágenes de células humanas de iPS adquiridas por el monitor CM20 en los días 1, 4 y 7 después del trasvase. La zona azul fue identificada por la función de reconocimiento de colonias automático del monitor.
La zona azul fue identificada por la función de reconocimiento de colonias automático del monitor.

Para las 12 cepas de células humanas de iPS, se supervisó el proceso de crecimiento durante los pasos 5-8 de forma continuada con el sistema CM20 (Fig. 2 A, B). Estas líneas celulares de iPS se sometieron a un intercambio del medio de cultivo y se subcultivaron al mismo tiempo. Se detectó que cada célula iPS proliferaba en un tiempo de duplicación de cerca 30 horas y que la velocidad de proliferación era ligeramente diferente entre las líneas celulares iPS. También, se descubrió que, entre las líneas celulares humanas iPS, había líneas celulares iPS (como la cepa B y la cepa C) cuyo tiempo de duplicación era casi constante entre los pasos. Esto confirma que los procesos de cultivo, como el cambio del medio de cultivo y el subcultivo, se realizaron correctamente (Fig. 2 C).

Por otro lado, algunas líneas celulares de iPS, como la cepa I y la cepa J, mostraron grandes variaciones en el tiempo de duplicación para cada trasvase (Fig. 2D). Estos resultados demuestran que las 12 líneas celulares de iPS tienen propiedades de crecimiento distintas.

Figura 2. Supervisión del estado de proliferación cuantitativa durante el mantenimiento del cultivo celular humano de iPS

(A) Interfaz del software del monitor CM20.
(B) Observación de un pocillo usando el monitor CM20. Imágenes de nueve campos de visión en los pocillos que se obtuvieron cada tres horas y escaneos completos que se ejecutaron todos los días de forma automática.
(C) Tiempo de duplicación en cada paso efectuado varias veces que se traza en gráfico conforme a cada línea celular iPS. La desviación estándar ± media (SD) se muestra en el gráfico de barras.
(D) Variación en el tiempo de duplicación para cada línea celular iPS mostrada en SD.

Ventajas del análisis cuantitativo

Gracias a que el monitor CM20 recopila datos cuantitativos sobre el proceso de crecimiento celular, es posible medir datos de distintas líneas celulares y compararlos usando los mismos estándares. El monitor permite recopilar datos fácilmente de varias cepas mantenidas por un investigador único o varios investigadores bajo el mismo proceso. Esto permite comprobar fácilmente si el proceso se efectuó correctamente al comprar las imágenes de las células y su crecimiento.

Anteriormente, cuando la calidad celular variaba, era difícil determinar si la causa eran las diferencias en las propiedades de las líneas celulares individuales o un error en el proceso de cultivo. En muchos estudios, particularmente los que usan iPS, se requiere bastante dedicación para llegar a la diferenciación celular deseada. Fue difícil medir cómo los cambios que pueden producirse durante el mantenimiento del cultivo iPS afectan a los resultados de evaluación de las células diferenciadas.

Olympus seguirá sus investigaciones con el sistema CM20 a fin de desarrollar métodos que logren una gestión de datos y un control de calidad más efectivos.

Comentario del Dr. Takebe y el Dr. Yoneyama