Comparação de linhas celulares iPS humanas utilizando o sistema de monitoramento de incubação CM20: observar a diferenciação em organoides do fígado derivados de células iPS

Introdução

As células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) são amplamente usadas em pesquisa básica sobre embriologia, como diferenciação de células, formação de órgãos, pesquisa de descoberta de medicamentos e desenvolvimento de métodos de diagnóstico para doenças. Até hoje, muitas linhas celulares iPS foram globalmente estabelecidas, mas as respectivas propriedades, como potencial de diferenciação e velocidade de crescimento, são diferentes entre cepas. Embora essas diferenças sejam conhecidas, nunca foram quantificadas utilizando células cultivadas nas mesmas condições ambientais. Isso torna difícil determinar se essas variações são devidas a diferenças no ambiente e procedimentos entre os laboratórios ou se são inerentes às próprias linhas de células. Mesmo que haja variações nas propriedades de células diferenciadas derivadas de células iPS, elas não são descobertas até que a cultura seja concluída, portanto, as células que foram induzidas a se diferenciar podem apresentar anormalidades. Neste contexto, é importante ter uma ferramenta que permita o monitoramento de longo prazo de células iPS, bem como o controle de qualidade e o gerenciamento de dados eficientes do processo até ao experimento de indução a diferenciação.

Análise quantitativa de dados da cultura de células usando o sistema de monitoramento de incubação CM20

Com as medições quantitativas fornecidas pelo sistema de monitoramento de incubação CM20 da Olympus, analisamos pontos de controle de variações na criação de organoides por células iPS e estabelecemos um método para analisar o contexto do genoma das doenças com base na comparação de vários espécimes. Nesse estudo, foram cultivadas 12 cepas de células iPS humanas de vários dadores usando o mesmo processo, e foram obtidos dados sobre o processo de crescimento de cada linha celular usando o sistema de monitoramento de incubação CM20 da Olympus.

Protocolo de culturas

A manutenção das culturas de células iPS humanas foi realizada em uma placa de 6 poços em condições isentas de alimentador usando o meio StemFit AK02N (Ajinomoto Co., Inc.) e a matriz de revestimento de placas iMarix-511 (Matrixome Inc.). Elas foram subcultivadas usando unicelularidade com uma solução Accutase removível com cultura a 1,0–2,0 × 104 células/poço e cultivadas em meio StemFit AK02N suplementado com Y-27632 durante 24 horas. Em seguida, as células iPS humanas foram proliferadas por troca com meio StemFit AK02N sem Y-27632 e cultivadas cerca de 1 semana, trocando o meio a cada dois dias (Fig. 1).

Figura 1. Como são cultivadas as células iPS humanas

Imagens de células iPS humanas adquiridas pelo monitor CM20 nos dias 1, 4 e 7 após passagem. A área azul foi identificada pela função automática de reconhecimento de colônias do monitor.
A área azul foi identificada pela função automática de reconhecimento de colônias do monitor.

Para as 12 cepas de células iPS humanas, o processo de crescimento durante 5 a 8 passagens foi monitorado continuamente com o sistema CM20 (Fig. 2A, B). Essas linhas celulares iPS foram submetidas a troca de meios e subcultura ao mesmo tempo. Foi observado que cada célula iPS proliferou em um tempo de duplicação de cerca de 30 horas e a velocidade de proliferação foi ligeiramente diferente entre linhas celulares iPS. Foi também observado que entre as linhas celulares iPS humanas, existem linhas celulares iPS (como a cepa B e a cepa C) cujo tempo de duplicação é quase constante entre passagens. Isso vem confirmar que os processos de cultura, como a subcultura e a substituição de meios, foram realizados corretamente (Fig. 2C).

Por outro lado, algumas linhas celulares iPS, como a cepa I e a cepa J, mostraram grandes variações no tempo de duplicação para cada passagem (Fig. 2D). Tais resultados demonstram que as 12 linhas celulares iPS possuem propriedades de crescimento diferentes.

Figura 2. Monitoramento do estado de proliferação quantitativa durante a manutenção da cultura de células iPS humanas

(A) Interface de software do monitor CM20.
(B) Observação de poço único usando o monitor CM20. As imagens de 9 campos de visão nos poços são adquiridas a cada 3 horas e todos os poços são rastreados diariamente de forma automática.
(C) O tempo de duplicação de cada passagem que foi realizada várias vezes é representado graficamente por cada linha celular iPS. A média ± do desvio-padrão (DP) é mostrada pelo gráfico de barras.
(D) A variação no tempo de duplicação de cada linha celular iPS é mostrada em DP.

Vantagens da análise quantitativa

Como o monitor CM20 coleta dados quantitativos sobre o processo de crescimento celular, é possível medir e comparar dados de várias linhas celulares usando os mesmos padrões. O monitor facilita a coleta de dados de várias cepas que foram mantidas por um único pesquisador com o mesmo processo, assim como a coleta de dados de vários pesquisadores. Isso torna mais fácil verificar se o processo foi realizado corretamente, através da comparação entre o crescimento e as imagens das células.

No passado, quando a qualidade das células era variável, era difícil constatar se isso era causado por diferenças nas propriedades das linhas celulares individuais, ou se um erro no processo de cultura seria a origem da variação no processo de cultura de células quando a qualidade variava. Especificamente, muitos estudos usando células iPS requeriam bastante trabalho para obter as células diferenciadas desejadas. Era difícil medir como as alterações que podem ocorrer durante a manutenção de culturas iPS afetam os resultados de avaliação de células diferenciadas.

A Olympus continuará pesquisando com o CM20 com o objetivo de desenvolver métodos para o controle de qualidade e o gerenciamento de dados eficientes.

Comentários do Dr. Takebe e do Dr. Yoneyama