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Notas de aplicação

Distinguindo vasos sanguÌneos cerebrais e tumorais em tecidos profundos usando microscopia multifÛton


A microscopia convencional de excitação por dois fótons (2PE) usa geralmente luz laser na região NIR-I (700–950 nm) como fonte de luz de excitação, limitando a profundidade da formação de imagens a cerca de 500 µm. Quando comparada com a luz NIR-I, a luz NIR-II (1.000–1.700 nm) demonstra uma atenuação de luz mais reduzida em tecidos biológicos. A luz NIR-II consegue também penetrar mais profundamente para excitar os fluoróforos durante a formação de imagens de tecidos in vivo. Além disso, a autofluorescência induzida pela luz NIR-II é significativamente mais baixa que a da luz NIR-I, ajudando a melhorar a relação sinal/fundo das imagens 2PE.

O microscópio de excitação multifóton FVMPE-RS da Olympus está equipado com sistema laser pulsado IR InSight DS para permitir a formação de imagens multifotônicas com excitação entre 680–1.300 nm. Seguem-se duas aplicações de formação de imagens profundas in vivo que beneficiam do uso do microscópio de excitação multifóton com luz NIR-II.

1. Pontos de polímeros conjugados excitáveis por NIR-II para formação de imagens de dois fótons no cérebro in vivo em profundidade através de um crânio intato[1]

A microscopia 2PE através de um crânio intato de camundongo é desafiadora devido à forte dispersão induzida pelo osso craniano. Para superar esse desafio, desenvolvemos pontos de polímeros conjugados (CPdots) de cadeia única e excitáveis por luz NIR-II com fluorescência brilhante na região NIR-I (pico a cerca de 725 nm e rendimento quântico de 20,6 ± 1,0%) para formação de imagens 2PE in vivo em profundidade de um cérebro intato de camundongo. Usando o FVMPE-RS da Olympus equipado com sistema laser sintonizável ultrarrápido, efetuamos a formação de imagens 2PE do cérebro de camundongo durante a excitação a 800, 1.040 e 1.200 nm. Esse sistema possibilita a sintonização livre do comprimento de onda sem trabalho de ajuste complicado. A excitação a 1.200 nm originou a maior profundidade na formação de imagens e a mais alta relação sinal/fundo. Além disso, foi obtida uma reconstrução 3D da rede de vasos sanguíneos do cérebro com uma grande profundidade vertical de 400 µm através do crânio intacto.

Figura 1-01

Figura 1-02

Figura 1-03

Figura 1-04

Figura 1. Imagens 2PE da vasculatura cerebral em um camundongo injetado com pontos de PC adquiridas na mesma coluna cortical (em uma profundidade de 300 µm) durante a excitação por laser fs a 800, 1.040 e 1.200 nm. A emissão foi coletada entre 660–750 nm. Cada quadro foi adquirido em 3,22 s. Todas as imagens apresentam a mesma barra de escala: 100 µm. Foram representados graficamente perfis de intensidade da linha 2PE ao longo dos vasos sanguíneos de cada quadro. Copyright 2019, Wiley-VCH.
 

Figura 2-01

Figura 2-02

Figura 2-03

Figura 2-04

Figura 2. Imagens 2PE reconstruídas em 3D dos vasos sanguíneos do cérebro através de um crânio intato. Excitação para geração de segundo harmônico (SHG, cor azul): 950 nm; excitação para 2PE: 1.200 nm. As emissões foram coletadas entre 455–500 nm para a SHG e entre 660–750 nm para os vasos sanguíneos. Cada quadro foi adquirido em 3,22 s. Copyright 2019, Wiley-VCH.
 

Vídeo 1. Imagem 2PE reconstruída em 3D dos vasos sanguíneos do cérebro marcados com CPdots. Excitação: 1.200 nm. Emissões: 660–750 nm. Copyright 2019, Wiley-VCH.

2. Microscopia intravital de excitação por dois fótons e NIR-II distingue vasculaturas cerebrais e tumorais profundas[2]

A formação de imagens de fluorescência intravital da morfologia da vasculatura e das dinâmicas no cérebro e tumores com uma grande penetração em profundidade e alta relação sinal/fundo (SBR) é ideal para estudo e teragnóstico de cânceres e doenças relacionadas com vasos. Um fluoróforo altamente brilhante com emissão NIR induzida por agregação foi concebido para a microscopia intravital de excitação por 2PE e luz NIR-II em cérebros e tumores. Graças à profunda capacidade de penetração da luz NIR-II e ao alto brilho do fluoróforo, foi possível formar imagens das vasculaturas em tecidos profundos (cérebro e tumores).

Esquema 1. Ilustração esquemática da formação de imagens de fluorescência in vivo com dois fótons do tumor sob excitação NIR-I e NIR-II. Copyright 2019, Wiley-VCH.

Esquema 1. Ilustração esquemática da formação de imagens de fluorescência in vivo com dois fótons de um tumor sob excitação NIR-I e NIR-II. Copyright 2019, Wiley-VCH.
 

Figura 3. Imagem 2PE de vasos sanguíneos normais e tumorais marcados com nosso fluoróforo. Os vasos sanguíneos tumorais mostram uma 2PE melhorada em comparação com vasos normais. Excitação: 1.200 nm; Emissões: 660–750 nm. Copyright 2019, Wiley-VCH.

Figura 3. Imagem 2PE de vasos sanguíneos normais e de um tumor marcados com nosso fluoróforo. Os vasos sanguíneos tumorais mostram uma 2PE melhorada em comparação com vasos normais. Excitação: 1.200 nm; Emissões: 660–750 nm. Copyright 2019, Wiley-VCH.
 

Figura 4-a

Figura 4-b

Figura 4. Imagens 2PE reconstruídas em 3D das redes de vasculatura tumoral presentes no mesmo tumor sob excitação NIR-II (a) e NIR-I (b). Excitações: 1.200 nm para NIR-II e 920 nm para NIR-I. Barras de escala: 100 μm. Profundidade da formação de imagens (através da pele): 500 μm para excitação NIR-II e 300 μm para excitação NIR-I. Copyright 2019, Wiley-VCH.

Referências:

[1] NIR‐II Excitable Conjugated Polymer Dots with Bright NIR‐I Emission for Deep In Vivo Two‐Photon Brain Imaging Through Intact Skull
[2] NIR-II-Excited Intravital Two-Photon Microscopy Distinguishes Deep Cerebral and Tumor Vasculatures with Ultrabright NIR-I AIE Luminogen

Equipamento de aquisição de imagens

Microscópio: sistema FVMPE-RS
Objetiva: objetiva de imersão em água de 25X (XLPLN25XWMP2)

Comentários: Dr. Shaowei Wang

O microscópio multifóton FVMPE-RS da Olympus é uma ferramenta poderosa para a formação de imagens intravitais. O laser IV pulsado InSight DS com comprimentos de onda sintonizáveis entre 680–1.300 nm é útil em várias aplicações de formação de imagens de fluorescência in vivo com dois fótons. Graças ao revestimento óptico otimizado e à excelente objetiva com alta transmitância na região NIR-II, foi possível efetuar microscopia intravital de excitação por dois fótons e NIR-II com nossos fluoróforos ultrabrilhantes. A profundidade da formação de imagens e a relação sinal/fundo melhoraram sob a excitação NIR-II.

Comentários: Dr. Shaowei Wang

Agradecimentos

Esta nota de aplicação foi preparada com a ajuda do pesquisador:
Dr. Shaowei Wang, Departamento de Engenharia Química e Biomolecular, Universidade Nacional de Singapura (Principal)

Como o FVMPE-RS tornou nosso experimento mais fácil

Transmissão eficiente de laser em NIR-II

Transmissão eficiente de laser em NIR-II

Os espelhos do escâner revestidos de prata ajudam a oferecer mais potência de laser à sua amostra para gerar imagens mais claras. Quando comparada com os espelhos revestidos de alumínio convencionais, a refletância aumentada na faixa do infravermelho próximo é especialmente vantajosa para experimentos in vivo em profundidade.
Além disso, as objetivas MPE da Olympus e a óptica do escâner possuem o revestimento Olympus 1600 que oferece uma transmissão excelente de 400 nm a 1.600 nm.

Formação de imagens fácil de usar com alinhamento automático do laser.

Formação de imagens fácil de usar com alinhamento automático do laser

O desvio do laser causado pela sintonização do comprimento de onda pode originar um desalinhamento do feixe de excitação que reduz a qualidade de imagens multifóton em sistemas típicos.
O FVMPE-RS mantém o alinhamento preciso do laser em 4 eixos do feixe de excitação na unidade de escâner. A posição e o ângulo do feixe são ajustados automaticamente para oferecer uma potência do laser maior e um registro de píxel consistente.

Produtos usados nesta aplicação

Microscópio de escaneamento a laser multifóton

FV4000MPE

  • Adquira dados de imagens quantitativos e precisos desde a escala macro até estruturas subcelulares
  • Obtenha mais informações de uma única imagem multicolorida
  • Monitore neurônios e outras dinâmicas essenciais com formação de imagens de alta velocidade

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