Unterscheidung von Hirn- und Tumorblutgefäßen in tiefen Geweben mit der Multiphotonenmikroskopie

Bei der konventionellen Zwei-Photonen-Anregungsmikroskopie (2PE) wird typischerweise Laserlicht im NIR-I-Spektrum (700–950 nm) als Anregungslichtquelle verwendet, wodurch die Abbildungstiefe auf etwa 500 µm begrenzt ist. Bei Licht im NIR-II-Spektrum (1000–1700 nm) dagegen ergibt sich gegenüber dem NIR-I-Spektrum eine geringere Lichtabschwächung in biologischen Geweben. Licht im NIR-II-Spektrum kann viel tiefer eindringen, um die Fluorophore bei der In-vivo-Gewebebildgebung anzuregen. Darüber hinaus ist die durch Licht im NIR-II-Spektrum induzierte Autofluoreszenz viel geringer als bei Licht im NIR-I-Spektrum, so dass der Signal-Rauschabstand von 2PE-Bildern besser ist.

Das Multiphotonen-Anregungsmikroskop FVMPE-RS von Olympus ist mit einem gepulsten IR-Lasersystem InSight DS ausgestattet, das Multiphotonen-Imaging mit Anregungswellenlängen von 680–1300 nm ermöglicht. Hier sind zwei Anwendungen für das In-vivo-Imaging tiefer Schichten, die von der Verwendung eines Multiphotonen-Anregungsmikroskops mit NIR-II-Licht profitieren.

1. Mit Licht im NIR-II-Spektrum anregbare konjugierte Polymerdots für das Zwei-Photonen-Imaging tiefer Gehirnschichten in vivo durch einen intakten Schädel^[1]

Die 2PE-Mikroskopie durch einen intakten Mausschädel ist aufgrund der starken Streuung durch den Schädelknochen eine Herausforderung. Dazu entwickelten wir im NIR-II-Spektrum anregbare Dots aus einem einkettigen konjugierten Polymer (CPdots) mit heller Fluoreszenz im NIR-I-Spektrum (Peak bei ≈725 nm und Quantenausbeute 20,6 ± 1,0 %) für das 2PE-In-vivo-Imaging tiefer Gehirnschichten eines intakten Maushirns. Das 2PE-Imaging des Maushirns führten wir mit Anregungswellenlängen von 800, 1040 und 1200 nm auf dem FVMPE-RS System von Olympus mit einem ultraschnell abstimmbaren Lasersystem durch. Mit diesem System konnten wir die Wellenlänge des Lasers frei und ohne komplizierte Einstellarbeiten abstimmen. Mit der 1200-nm-Anregung erreichten wir die größte Abbildungstiefe und den höchsten Signal-Rauschabstand. Darüber hinaus erhielten wir eine 3D-Rekonstruktion der Hirnblutgefäße mit einer vertikalen Tiefe von 400 µm durch den intakten Schädel.

Abbildung 1: 2PE-Bilder des Hirngefäßsystems einer Maus nach Injektion von CPdots, aufgenommen in derselben kortikalen Säule (in einer Tiefe von 300 µm) mit fs-Laseranregung bei Wellenlängen von 800, 1040 und 1200 nm. Die Emission wurde im Bereich 660–750 nm erfasst. Jedes Einzelbild wurde in 3,22 s erfasst. Alle Bilder haben die gleiche Maßstableiste: 100 µm. Es wurden die 2PE-Linienintensitätsprofile der Blutgefäße aus jedem Einzelbild aufgetragen. Copyright 2019, Wiley-VCH.
 

Abbildung 2: 3D-Rekonstruktion von 2PE-Bildern der Hirnblutgefäße durch einen intakten Schädel. Anregung zur Erzeugung einer Frequenzverdopplung (Second Harmonic Generation bzw. SHG, blaue Farbe): 950 nm; Anregung für 2PE: 1200 nm. Die Emissionen wurden im Bereich 455–500 nm für SHG und 660–750 nm für Blutgefäße erfasst. Jedes Einzelbild wurde in 3,22 s erfasst. Copyright 2019, Wiley-VCH.
 

Video 1. 3D-Rekonstruktion eines 2PE-Bilds der mit CPdots markierten Hirnblutgefäße. Anregung: 1200 nm. Emission: 660–750 nm. Copyright 2019, Wiley-VCH.

2. Im NIR-II-Spektrum angeregte intravitale Zwei-Photonen-Mikroskopie unterscheidet tiefe Hirn- und Tumorgefäße^[2]

Die intravitale Fluoreszenz-Bildgebung der Gefäßmorphologie und -dynamik im Gehirn und in Tumoren mit großer Eindringtiefe und hohem Signal-Rauschabstand (SBR) eignet sich ideal zur Untersuchung und Theranostik von Gefäßerkrankungen und Karzinomen. Für die mit NIR-II-Licht angeregte intravitale 2PE-Mikroskopie von Gehirnen und Tumoren wurde ein ultraheller Fluorophor mit aggregationsinduzierter NIR-Emission entwickelt. Aufgrund der tiefen Penetration des NIR-II-Lichts und der starken Helligkeit des Fluorophors konnten wir die Gefäße in tiefen Geweben (Gehirn und Tumoren) abbilden.

Schema 1. Schematische Darstellung des Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Imagings eines Tumors in vivo mit Anregung im NIR-I- und NIR-II-Spektrum. Copyright 2019, Wiley-VCH.
 

Abbildung 3: 2PE-Abbildung eines Tumors und normaler Blutgefäße, markiert mit unserem Fluorophor. Das Tumorblutgefäß zeigt im Vergleich zum normalen Gefäß eine verstärkte 2PE. Anregung: 1200 nm; Emission: 660–750 nm. Copyright 2019, Wiley-VCH.
 

Abbildung 4: 3D-Rekonstruktion der 2PE-Bilder von Tumor-Gefäßen im gleichen Tumor bei Anregung mit Licht im NIR-II-Spektrum (a) und NIR-I-Spektrum (b). Anregung: 1200 nm für NIR-II--Spektrum und 920 nm für NIR-I-Spektrum. Maßstableisten: 100 μm. Abbildungstiefe (durch die Haut): 500 μm bei Anregung im NIR-II-Spektrum und 300 μm bei Anregung im NIR-I-Spektrum. Copyright 2019, Wiley-VCH.

Literaturnachweise:

[1] Mit Licht im NIR-II-Spektrum anregbare konjugierte Polymerdots mit heller NIR-I-Emission für das Zwei-Photonen-Imaging tiefer Gehirnschichten in vivo durch einen intakten Schädel
[2]Die intravitale Zwei-Photonen-Mikroskopie mit Anregung im NIR-II-Spektrum unterscheidet tiefe Hirn- und Tumor-Gefäße mit ultrahellem NIR-I AIE-Luminogen

Bildgebende Geräte

Mikroskop: FVMPE-RS-System
Objektiv: 25X Wasserimmersionsobjektiv (XLPLN25XWMP2)

Kommentar von Dr. Shaowei Wang

Das Multiphotonenmikroskop FVMPE-RS von Olympus ist ein leistungsstarkes Werkzeug für die intravitale Bildgebung. Der gepulste InSight DS IR-Laser mit durchstimmbaren Wellenlängen von 680–1300 nm ist für verschiedene In-vivo-Anwendungen für das Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Imaging geeignet. Aufgrund der optimierten optischen Beschichtung und des exzellenten Objektivs mit hoher Transmission im NIR-II-Spektrum konnten wir mit unseren ultrahellen Fluorophoren eine intravitale Zwei-Photonen-Mikroskopie mit Anregung im NIR-II-Spektrum durchführen. Die Abbildungstiefe und der Signal-Rauschabstand verbesserten sich bei Anregung im NIR-II-Spektrum.

Danksagungen

Dieser Anwendungshinweis wurde mit Hilfe folgender Forscher erstellt:
Dr. Shaowei Wang, Department of Chemical and Biomolecular Engineering, National University of Singapore (Homepage)

Vorteile des FVMPE-RS für unser Experiment