Análise de imagem fluorescente — Ensaio de células vivas/mortas de esferoides

A proporção de células mortas dentro dos esferoides e a eficácia dos medicamentos podem ser avaliadas quantitativamente usando um microscópio confocal e o módulo de contagem de células do software NoviSight™.

Objetivos

A distância entre a superfície de um tumor e o núcleo tem um gradiente de difusão de oxigênio ou nutrientes, e esse ambiente severo causa células em repouso ou mortas no interior do tecido tumoral. Espera-se que um modelo de esferoides recapitule o microambiente tumoral. Anteriormente, cada seção precisava ser preparada separadamente para observar o interior das amostras 3D. No entanto, o desenvolvimento da tecnologia de limpeza de tecido agora torna possível observar o interior das amostras 3D, preservando sua integridade estrutural. Neste estudo, imagens confocais de esferoides tumorais tingidos com fluorescência, tratados com um medicamento, fixados e tornados transparentes, foram submetidos a análise quantitativa 3D usando o software NoviSight™. O estudo demonstra que a morte celular independente e dependente de medicamentos pode ser confirmada usando um reagente de limpeza e o software NoviSight™.

Preparação de amostras

Foi semeada uma suspensão de células HT-29 em placas PrimeSurface® 96U (SUMITOMO BAKELITE CO., LTD), uma placa de fundo em U, a 500 células/poço. Foram adicionadas Estaurosporina (STS) em várias concentrações e NucView550 a cada poço 8 dias após o início da cultura de células. Após incubação por 1 dia, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% e permeabilizadas com TritonX-100/PBS a 0,5%. Em seguida, os núcleos das células foram tingidos com Hoechst 33342 de um dia para o outro a 4 °C, e os esferoides foram transparentizados com ScaleS.

Conclusão
Aquisição e análise de imagens fluorescentes

Foram obtidas imagens fluorescentes confocais dos esferoides mencionados acima usando o microscópio confocal a laser FV3000. Mesmo na ausência de STS, os núcleos das células no interior dos esferoides foram tingidos com NucView550 (A), indicando a ocorrência da apoptose. O reconhecimento de núcleos celulares e a análise de contagem de células usando o software NoviSight™ permitem a quantificação da proporção de células mortas (B), e confirmamos que a morte celular induzida por STS ocorreu de uma maneira dependente da dose (C, D). Esses resultados demonstram como o software NoviSight™ pode contribuir para a avaliação quantitativa da morte celular 3D induzida por medicamentos.

PrimeSurface é uma marca registrada da Sumitomo Bakelite Co., Ltd.
Olympus é uma marca registrada e NoviSight e Insightful Analysis, Intelligent Answers são marcas da Olympus Corporation.