Some cells present with two different colors (e.g., green and blue), suggesting two different cell-cycle stages. Is this an indication that the model is not performing correctly?

The system can differentiate between multiple colors/channels, so when two different colors are present, the software identifies background from foreground (where the foreground is the cell layer). However, because some cell-cycle stages can be identified with morphological features, we strongly suggest using a cell-stage tag to mark different cell stages. This will be integral to ensure that training (deep learning) is performed with all cell-cycle stages that you want to differentiate. Nevertheless, since cells are evaluated per pixel and not “per cell,” there are scenarios where the system will be able to automatically discern cell-cycle stages, even if you did not specifically train with that stage.

How does the system perform when analyzing spheroid cultures or other cultures?

The scanR system is designed to efficiently work with spheroid cultures or other types of culture as well. There are some workflow details that we have observed to work well with this application. First, we recommend you apply 3D deconvolution to images collected, and then carry out manual annotation. An example workflow would involve using 10–20 images and manually segmenting 10 cells.

Can you image the borders of the wells in 384-well plates?

Yes, but there are limitations. The ability to image well borders is dependent on the combination of the type of well plate and the objective used. Well plates come in a variety of forms, including skirted, semi-skirted, and non-skirted. Therefore, the important information when imaging well borders is the difference in height between the bottom of the plate and the bottom of the skirt. As such, there comes a point where the vertical distance of the bottom of the plate to the bottom of the skirt prevents a high magnification objective from imaging, because the objective may collide with the plate. In this case, we strongly suggest a long-working distance objective. Specifically, Olympus offers a great range of long-working distance objectives.

How is focusing done in the scanR system?

The scanR system uses a combination of hardware and software autofocus. The hardware autofocus detects the bottom surface of the cell, and the software autofocus finds the sample portion. This is a very robust process, so you can basically walk away from the system once you’ve started the experiment.

Can you use the super-resolution spinning disk system for high-content screening?

Yes, you can use the scanR software to control the Olympus IXplore SpinSR microscope system. It is possible to achieve 120 nm resolution with this system and then import acquired images into cellSens software for further processing and even better results.

How well does the segmentation and deep learning perform on tissue slices?

In our experience, segmentation works well on tissue slices, especially when using the spinning disk system. However, it is possible to acquire good images without the spinning disk system by just applying 3D deconvolution. If tissues are particularly difficult to work with, then deep learning with manual annotation has been shown to work well. Manual annotation provides the deep-learning algorithm a robust training set from which to learn and better predict segments, based on user identification.

Triagem de alto conteúdo: análise personalizada simplificada

Neste webinar, Manoel e Shohei, nossos especialistas em deep learning e triagem de alto conteúdo, apresentarão o criador de ensaios do sistema scanR. O sistema scanR é a plataforma dedicada de triagem de alto conteúdo da Olympus com uma abordagem única de navegação de amostras e análise inspirada na citometria de fluxo.

Perguntas frequentes

Perguntas frequentes sobre o webinar | Triagem de alto conteúdo: análise personalizada simplificada

Algumas células apresentam duas cores diferentes (por exemplo, verde e azul), sugerindo duas fases diferentes do ciclo celular. Isso é uma indicação de que o modelo não está funcionando corretamente?

O sistema pode diferenciar entre múltiplas cores/canais, de modo que quando há duas cores diferentes, o software identifica o fundo do primeiro plano (onde o primeiro plano é a camada de células). Contudo, como algumas fases do ciclo celular podem ser identificadas com características morfológicas, sugerimos fortemente o uso de uma etiqueta de fase celular para marcar as diferentes fases celulares. Isso será fundamental para garantir que o treinamento (deep learning) seja realizado com todas as fases do ciclo celular que você deseja diferenciar. Entretanto, como as células são avaliadas por pixel e não "por célula", há cenários em que o sistema será capaz de discernir automaticamente as fases do ciclo celular automaticamente, mesmo que você não tenha treinado especificamente com essa fase.

Como o sistema funciona ao analisar culturas de esferoides ou outras culturas?

O sistema scanR é projetado para funcionar eficazmente com culturas de esferoides ou com outros tipos de cultura. Existem alguns detalhes do fluxo de trabalho que nós observamos que funcionam bem com esta aplicação. Primeiro, recomendamos que você aplique a deconvolução 3D às imagens coletadas e, em seguida, faça a anotação manual. Um exemplo de fluxo de trabalho consistiria em usar 10–20 imagens e segmentar manualmente 10 células.

É possível obter imagens das bordas dos poços nas placas de 384 poços?

Sim, mas existem limitações. A capacidade de obter imagens das bordas dos poços depende da combinação do tipo de placa de poços e da objetiva usada. As placas de poços vêm em uma variedade de formas, incluindo com saia, semissaia e sem saia. Portanto, a informação importante ao obter imagens das bordas dos poços é a diferença de altura entre o fundo da placa e o fundo da saia. Dessa forma, chega-se a um ponto em que a distância vertical do fundo da placa até o fundo da saia impede que uma objetiva de alta ampliação obtenha imagens, pois a objetiva pode colidir com a placa. Nesse caso, sugerimos fortemente uma objetiva de longa distância de trabalho. Particularmente, a Olympus oferece uma grande variedade de objetivas de longa distância de trabalho.

Como é feito o foco no sistema scanR?

O sistema scanR usa uma combinação de foco automático de hardware e software. O foco automático de hardware detecta a superfície inferior da célula e o foco automático de software encontra a parte da amostra. Esse é um processo muito robusto, de modo que basicamente você pode abandonar o sistema depois de iniciar o experimento.

É possível usar o sistema de disco giratório de super-resolução para a triagem de alto conteúdo?

Sim, é possível usar o software scanR para controlar o sistema de microscópio Olympus IXplore SpinSR. É possível atingir uma resolução de 120 nm com esse sistema e, em seguida, importar as imagens adquiridas para o software cellSens para processamento posterior e resultados ainda melhores.

Qual é o desempenho da segmentação e do deep learning em cortes de tecido?

De acordo com a nossa experiência, a segmentação funciona bem em cortes de tecido, especialmente ao usar o sistema de disco giratório. Contudo, é possível adquirir boas imagens sem o sistema de disco giratório apenas aplicando a deconvolução 3D. Se os tecidos são particularmente difíceis de trabalhar, o deep learning com anotação manual tem mostrado funcionar bem. A anotação manual fornece ao algoritmo de deep learning um conjunto de treinamento robusto a partir do qual aprender e prever melhor os segmentos, com base na identificação do usuário.

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