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应用资料

3D活/死细胞测定的分析工作流程


摘要

NoviSight 3D细胞分析软件可通过测量体积、球形度和细胞数等参数提供有关微球和其他3D对象的统计数据。本应用指南将介绍用于活/死微球测定的NoviSight 3D细胞分析工作流程。

引言

使用微球或类器官进行3D高内涵分析(HCA)的难度可能很大。理想情况下,我们可以通过三维方式分析3D样品获得有关形态和内部条件的信息。NoviSight软件的真实3D分析可通过基于连续Z序列荧光图像测量3D样品的体积、细胞数量和细胞状况,从而简化这一过程。另一方面,常规分析使用的单个图像切片(图1,左,2D分析)或使用投影图像(图1,中,2.5D分析)。这两种技术均会从3D样品中丢失诸如空间、形态和体积信息等大量数据(图1)。

在本应用指南中,我们介绍如何使用活/死微球测定法通过NoviSight软件定量分析3D样品。

Figure 1

图1 (从左到右):2D、2.5D和3D分析示意图。

方法

样品制备

我们在PrimeSurface®96U孔板(Sumitomo Bakelite)中培养500 HT-29细胞/孔八天以形成微球,然后第二天用NucView® 550 (Biotium)施用不同浓度的星形孢菌素(STS)。NucView 550是caspase-3荧光探针,死细胞核用红色荧光染色。用STS和NucView 550处理后,将HT-29微球用4%多聚甲醛固定并用0.5%Triton X-100 / PBS(-)通透性处理。微球的细胞核在4°C(39.2°F)下用Hoechst 33342过夜染色。染色后,用SCALEVIEW-S4将微球透明化。

成像和分析

我们使用FV3000激光扫描共聚焦显微镜和半复消色差物镜(LUCPLFLN20X)在三个维度上对样品进行成像。采集条件如下所示。Z轴步进为2μm。Hoechst 33342使用405 nm激光(蓝色荧光),NucView 550使用561 nm激光(洋红色荧光)。图2显示为使用显微镜采集的未经处理和经STS处理的微球体积图像。未经处理经8天培养微球的核心区域可能因营养不足或低氧而死亡。总体而言,STS诱导HT-29微球细胞死亡。
 

Figure 2

图2:使用(右侧)和不使用(左侧)STS的HT-29微球体积视图。
 

优点

  • 轻松进行3D活/死活力测试
  • 直观的用户界面可帮助您将Z-堆叠图像转换为可再现的定量数据
     

3D活/死微球分析策略

使用NoviSight™软件定量分析活/死微球时,需要执行表1中列出的步骤。为了让NoviSight软件能够从Z平面图像以三维方式识别细胞核,可将Z截面的步进设置为3μm,这是检测单个细胞核的最大测量值。
 

步骤 详细信息
样品制备 细胞培养和荧光染色
选项:固定和透明化
如果想要分析细胞数,则应对细胞核染色
成像 获取多个Z序列图像
共聚焦显微镜,多光子显微镜
分析 1.识别诸如细胞核、体积、细胞器等感兴趣的对象。
2.设置分析参数
3.通过圈门进行图形分析
4.统计分析
 

表1:从样品制备到分析的3D分析工作流程。
 

NoviSight软件分析步骤

主要对象识别

通过活/死细胞数量评估活/死细胞测定。NoviSight软件可以从细胞核染剂中检测细胞数量。为了识别细胞核,我们使用了专门的NoviSight模块进行核检测:NuclearL。在输入适当的细胞大小、背景强度和Z / XY比(核的Z轴伸长)后,NoviSight软件就可以自动检测3D空间中微球细胞核(图3A)。

分析参数设置

对于使用Hoechst 33342染色的所有细胞核,NucView 550信号强度高的细胞均为死细胞。结果,NoviSight软件能够通过已识别核对象上的CH2(NucView 550)强度等级对活/死细胞进行分类(图3B)。也就是说NoviSight软件仅使用核识别设置就可以对微球活/死细胞进行分类。

Figure 3

图3:识别父母对象。(A)核被NuclearL模块所识别。每个被识别的核均被用彩色圆圈圈上。(B)设定分析参数。例如,参数10是主要对象(核)上CH2(死信号)的最大强度。
 

核识别完成后,就可以在散点图或直方图中将识别出的核绘制为对象数据。散点图的X轴或Y轴可以根据分析参数进行调整。当将其分别设置在中心X / Y时,将主要对象的中心X / Y绘制在图形上(图4A)。点击图形中的一个点时,NoviSight软件即可指向原始图像中的相同位置(图4B)。
 

Figure 4

图4:微球的定量分析图像。(A)当分别在X和Y轴上设置中心X和Y分析参数(在图3B中设置)时,在图中绘制每个被识别的核。可以根据需要调整X / Y轴上的分析参数(红色正方形)。(A / B)NoviSight软件可以将分析数据与原始图像以直观方式链接起来。点击图形中已识别核的图形(A,红色箭头)时,相同位置会在原始图像中自动显示(白色箭头)。
 

Figure 5

图5:细胞分类的图形化分析。
(A)当分别在X和Y轴上设置分析参数平均强度CH2(在图3B中设置)时,该图形以CH2(死信号)平均强度的顺序显示主要对象计数(核)。我们就可以通过CH2强度门控区分活细胞和死细胞。(B)以绿色显示已识别死区的体积视图。
 

统计分析

NoviSight软件可以同时分析多个样品。来自分析中的定量数据可以作为热图(图6A)显示,也可以导出为CSV文件用于进一步分析。数据也可以在每个门控中输出。这里的数据表明,在HT-29微球中处理各种浓度的STS时,STS以剂量依赖的方式诱导HT-29细胞凋亡(图6B)。

Figure 6

图6:带有或不带STS的HT-29微球活/死细胞分析的定量结果。(A)NoviSight软件输出每个门的定量数据。
数据也可在热图中显示。(B)STS以剂量依赖性方式增加HT-29细胞死亡。
 

连接数据和图像

数据和图像之间的链接是高内涵分析的主要优势。与酶标仪不同,HCA可以参考原始图像以目视方式确认细胞的形态、位置和强度。NoviSight™软件充分利用了这一功能。例如,当点击特定数据点或对象时,软件可以显示相应的图像(图7),例如:

  • 散点图上一个点
  • 图片集中一张图
  • 热图上一个孔
  • 图表中一个数字
     

Figure 7

散点图上的点图像组视图中的对象图像热图上的孔表格中的数字图7:点击数据点或对象时,NoviSight软件可在相应的图像上显示相同的点。
 

结论

3D样品的3D定量分析看上去很复杂,但是NoviSight软件可以从头到尾让您的工作流程得到简化。例如,细胞核识别是微球活/死分析的唯一参数。这种简化工作流程也可应用于相关3D模型。
 

作者

Mayu Ogawa(奥林巴斯)

Products used for this application

3D细胞分析软件

NoviSight

  • 从完整结构到亚细胞级别的3D图像识别
  • 统计分析
  • 多种默认检测方法

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