Evident LogoOlympus Logo

数字图像数据与生物标本之间的关系

本白皮书探讨了生物标本信号与显微镜数码相机数据之间的联系。了解这种关系可以帮助您设置最佳的图像采集条件,从而获得最高质量的图像和更准确的数据。
 

数字影像基础

显微镜单色相机是一种可以检测并可视化生物标本光信号的设备。显微镜观察到荧光染料或荧光蛋白所发射的荧光信号,一般通过相机进行收集,相机再将光信号转换为光电子作为数字信号进行检测。

检测到的信号值受多个参量综合影响,包括经过标记的靶分子的数量、激发光强度、荧光激发效率和检测效率(包括相机从光到数字信号的转换效率)等(图1)。

当您对不同的标本使用相同的设备和相同图像采集设置时,上述提到的参数中除了靶分子数量以外,其它参数均为恒定值,换言之,检测到的信号值与靶分子数量成正比。这就意味着,您可以对基因编辑标本和野生型对照组标本进行定量比较。
 

图1 – 从标本到数字信号的转化:(a)被激发的荧光标记分子发射荧光。 当标本中有更多的荧光标记物时,收集到的光强更强(b);而使用更强的激发光时,收集到的光强也会增加(c)。 信号强度与入射传感器的光强度(d)成正比。

图1 – 从标本到数字信号的转化:(a)被激发的荧光标记分子发射荧光。
当标本中有更多的荧光标记物时,收集到的光强更强(b);而使用更强的激发光时,收集到的光强也会增加(c)。
信号强度与入射传感器的光强度(d)成正比。 
 

信号与背景噪声剖析

本小节将着重介绍影响图像质量的核心因素,以及精心拍摄图像的重要性。

有效信号与背景信号:相机所检测到的信号包含有效信号和背景信号(背景噪声)。要从背景信号中识别出检测目标,您需要让有效信号强度与背景信号强度的比值足够高(图2),这就是信噪比(Signal-to-noise ratio, SNR)。获得更高的信噪比可以带来更高质量的图像和更准确的定量分析。

通常情况下,最大限度增加有效信号(例如,使用更高数值孔径的物镜)和最大限度降低背景信号(例如,使用暗室,更低制冷温度或更高量子效率的相机)是提高信噪比的常用方法。

需要注意的是,改变相机的增益设置并不会提高信噪比,因为它会同时改变有效信号和背景信号。

图2 – 左:低信噪比:背景噪声导致实际弱信号难以被识别。 右图:高信噪比:可以识别和测量标本中的有效信号。

图2 – 左:低信噪比:背景噪声导致实际弱信号难以被识别。
右图:高信噪比:可以识别和测量标本中的有效信号。

 

有效信号:如前所述,改善信噪比的一个方法是使用较高数值孔径的物镜,而另一个方法是使用高量子效率(QE)的相机。量子效率代表相机把采集到的光子转换为光电子的效率。切记,如果相机在特定波长下的量子效率为零,则相机将无法感知该波长的光强。例如,当我们为了防止串色而使用近红外染料如Cy7时,必须选择具有在720nm或更长波段的近红外区间感光能力的相机。

图3 – 左:灰线代表相机在检测各波长光线的量子效率。绿线和红线代表荧光染料的发射光谱。右图:检测到的总信号等于左图量子效率和荧光光谱的乘积(即坐标图中的绿色、红色面积大小)。在这个例子中,虽然红色荧光信号足够强,但对应波长范围的量子效率低,因此实际检测到信号值也非常弱。

图3 – 左:灰线代表相机在检测各波长光线的量子效率。绿线和红线代表荧光染料的发射光谱。右图:检测到的总信号等于左图量子效率和荧光光谱的乘积(即坐标图中的绿色、红色面积大小)。在这个例子中,虽然红色荧光信号足够强,但对应波长范围的量子效率低,因此实际检测到信号值也非常弱。
 

背景噪声:背景信号可分为: 

a)生物背景信号
b)非生物背景信号
c)光电子的统计学波动(散粒噪声)
d)相机噪声

散粒噪声非常独特,与抛硬币类似。正如尽管显示“正面”的概率为50%,但仍可能会在两次掷硬币时都得到“ 背面”一样,任何次数为N试验的统计波动均为±√(N)。所检测到的光电子数遵循相同的原理。

所有背景噪声示例如下面的图4中显示。

图4 – 背景噪声示例:(a)来自非特异性染色或自发荧光的生物发光背景,(b)载玻片上反射的室内环境光,(c)散粒噪声,(d)包含传感器热电子的相机噪声(左)和读出噪声(右)。可以通过传感器制冷的方式减少热电子。

图4 – 背景噪声示例:(a)来自非特异性染色或自发荧光的生物发光背景,(b)载玻片上反射的室内环境光,(c)散粒噪声,(d)包含传感器热电子的相机噪声(左)和读出噪声(右)。可以通过传感器制冷的方式减少热电子。 
 

分辨率:使用较大的像素尺寸或像素合并的方式采图可以捕获更多光信号从而提高信噪比,但是增大像素尺寸会降低图像分辨率(图5)。考虑与光学分辨率匹配的最佳像素尺寸。

图5 – 左:使用较大的像素尺寸可以获得更高的感光灵敏度,但会降低图像分辨率。 右:使用较小的像素尺寸可获得更高的图像分辨率,但会降低感光灵敏度。

图5 – 左:使用较大的像素尺寸可以获得更高的感光灵敏度,但会降低图像分辨率。
右:使用较小的像素尺寸可获得更高的图像分辨率,但会降低感光灵敏度。  

 

使用显微镜相机的最佳做法

尽管理想的图像采集设置会根据不同应用和标本而变化,但激发光强度和曝光时间这两个常见参数的平衡至关重要。更长的曝光时间或更强的激发光可获得更明亮的荧光,进而获得更高的信噪比,但这些操作也会增加光毒性。这就提出了一个重要问题:如何设置最佳的图像采集参数,可以降低激发光造成的细胞损伤,从而完成更长时间的活细胞成像实验呢?

若要确定理想的曝光时间,我们可以使用图像直方图。直方图的X轴为信号强度,Y轴代表了与图像中每个X轴数值对应的像素数量(图6)。

图6 – 图像的直方图(a)原始图像,(b)原始图像中每个像素的信号强度, (c)基于原始图像创建的直方图。

图6 – 图像的直方图(a)原始图像,(b)原始图像中每个像素的信号强度,
(c)基于原始图像创建的直方图。

 

一般情况下,即使不存在背景光,图像黑色背景区域的的像素信号值也不等于零(图7,左)。这样可以避免因图4(d)所述的读出噪声波动导致产生负值信号。直方图的形状和分布可以告诉我们当前的曝光时间是否合适。如果直方图在低信号范围内过于拥挤,则曝光时间太短(图7,中)。如果在最大信号处出现陡峭的“断崖”,则信号值已达到饱和(图7,右)。这种情况下,可以降低激发光强度或缩短曝光时间。

图7 – 正常曝光(左)、曝光不足(中)、 曝光过度(蓝色标记处达到饱和,右)时的直方图。

图7 – 正常曝光(左)、曝光不足(中)、
曝光过度(蓝色标记处达到饱和,右)时的直方图。 

 

一些图像采集分析软件具有自动调节显示(display adjustment)功能,可以在保持原始图像数据的同时获得更佳的展示效果。在大多数情况下,单色相机的信号动态范围(如16位= 65,536阶)要远大于显示器的动态范围(通常为8位= 256阶)。

调节显示功能可以改变信号强度和显示亮度之间的关联。通常标本中最强的信号也会远低于相机可处理的最大强度。对此,让显示动态范围与数据动态范围(从背景水平到最亮信号的范围)相匹配,就可以在不改变原始图像数据的同时让图像展示效果更佳(图8)。而使用直方图可以更方便地进行这样的显示调整。

图8 – 显示调整:(上)直方图中灰色垂直线代表了当前显示的动态范围,(中)显示亮度与信号强度之间的关系,(下)示例图像。左例图:原始显示设置。右例像:在保持原始图像数据不变的同时调节显示设置,图像展示效果更佳。

图8 – 显示调整:(上)直方图中灰色垂直线代表了当前显示的动态范围,(中)显示亮度与信号强度之间的关系,(下)示例图像。左例图:原始显示设置。右例像:在保持原始图像数据不变的同时调节显示设置,图像展示效果更佳。 
 

设置显微镜相机采集参数的六大步骤

接下来我们总结一下正确设置显微镜相机的六大步骤。需要注意的是,最佳操作步骤取决于您的具体应用和实际标本。

  1. 确定观察倍率。
  2. 调整标本的对焦,找到感兴趣的区域。进行这一步操作时,为缩短操作时间并最大限度降低光毒性,可以考虑在相机上使用更高的增益或像素合并模式。另外,我们还建议通过使用自动或手动调节显示在最佳状态下观察信号,并在不观察图像时关闭激发光光闸。
  3. 找到感兴趣区域后,重新设置增益和像素合并模式。
  4. 尝试使用最低的激发光强度,并检查是否可以在当前曝光时间内观察到信号。如果无法识别信号,或信噪比过低,可以尝试延长曝光时间。
  5. 如果曝光时间过长或者超出相机所允许的最大曝光时间,可以逐步尝试更高的激发光强度。
  6. 检查直方图确认信号没有过饱和。
     

结论

尽管显微成像的效果受多种因素影响,但了解数字成像的基础知识和技巧可以帮助您为每次实验确定最佳的采集参数。不论针对什么应用和实验,最大限度增强信号、降低背景噪声以及优化采集条件是提高实验数据质量的基本策略。
 

作者

Takeo Ogama
 
Takeo Ogama
Scientific Solutions Division
OLYMPUS CORPORATION OF THE AMERICAS

对不起,此内容在您的国家不适用。

相关产品
显微数码相机

DP74

DP74数码显微相机配备冷却式CMOS传感器,可以60 fps速度提供高质量彩色图像,实现清晰的荧光成像。该相机的位置导航器还提供对受关注区域的视觉跟踪。

  • 以60 fps的速度提供活体样品的高质量彩色图像
  • 位置导航器可实现对拼接图像中受关注区域的视觉跟踪
  • 冷却式CMOS传感器可获得清晰的低噪声荧光图像
显微专用数码相机

DP27

  • 500万像素彩色CCD
  • 存档的文件具有高的像素分辨率,且同时具有高质量色彩和高保真度
  • 用于明场观察最佳的对比度和彩色模式
显微专用数码相机

DP22

  • 280万像素彩色CCD
  • 用于会议和教学的快速高质量成像
  • 快速USB3.0连接
显微专用数码相机

UC90

  • 900万像素CCD相机
  • 单台相机适配多种应用
  • 捕捉高达4K UHD图像
显微数码相机

SC180

使用高分辨率SC180显微镜数码摄像头查看并记录样品的微小细节和结构。这款摄像头配备1,800万像素彩色CMOS传感器,提供以25 fps速度显示的快速4K UHD实时成像。

  • 可记录微小细节的1,800万像素彩色CMOS传感器
  • 便于进行具有洞察性观察的生动、低噪声图像
  • 快速4K UHD实时图像
显微专用数码相机

SC50

  • 经济,高性能
  • 智能化灵敏度
  • 轻松方便,彩色
显微镜数码相机

EP50

我们支持无线的EP50显微镜数码摄像头可将显微镜转变成无线成像系统,从而促进交互式学习。由于配备了完整的独立配置功能,您可以使用移动设备或PC控制EP50摄像头,并通过WLAN和HDMI将图像流式传输到显示器或投影仪。

  • 无线数码成像
  • WLAN和HDMI同时直接输出
  • 提供完整的独立配置
  • 灵活的摄像头控制选项可与移动设备、PC配合使用,或通过独立设置直接流式传输到显示器/投影仪

    *本产品在某些区域未推出
显微数码相机

LC30

  • 强大的310万像素CMOS彩色相机
  • 出色的色彩保真度和高帧频采集
  • 有效用于标准明场应用和数字文档编制
显微专用数码相机

XM10-IR

  • 140万像素黑白冷却CCD
  • 低噪音,高灵敏度
  • 在红外范围内灵敏度更高
显微专用数码相机

XM10

  • 140万像素黑白冷却CCD
  • 低噪音,高灵敏度
  • Fast Live成像速度
用于实现高分辨率的相机

sCMOS相机

科学级CMOS(sCMOS)相机针对活细胞成像进行了优化,与传统CMOS设备相比,噪点更少,量子效率更高。sCMOS相机的功能包括高速响应、宽泛动态范围、扩展视野、高分辨率和渐变。

  • 适用于高速的极快读出速度
  • 专为要求高分辨率的应用而设计
  • 适用于活细胞成像应用的高信噪比图像
用于弱荧光成像的相机

EM-CCD相机

电子倍增CCD摄像头放大光信号时不会增加噪点。它们可以捕获暗淡样品的高速图像,并且在激发光强度降低的情况下进行荧光活细胞成像时表现出色。它们用于观察细胞内的蛋白质相互作用以及用于实时成像。

  • 适用于探测超弱光的CCD技术
  • 超灵敏的专用科学级相机平台
  • 可量化和可再现的成像
Sorry, this page is not available in your country