Automatisierung des Arzneimittel-Screenings – von der Präparation von Krebssphäroiden bis zur 3D-Bildanalyse

Zusammenfassung

Eine Lösung zur Automatisierung des nahezu gesamten Arzneimittel-Screenings anhand von Krebssphäroiden unter Verwendung des automatisierten Systems zur Zellauswahl und Bildgebung CELL HANDLER von Yamaha in Kombination mit unserem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop FLUOVIEW FV3000 und der NoviSight Software (Abbildung 1). Dieser Prozess umfasst alle Schritte von der Probenpäparation bis hin zur 3D-Bildanalyse. Ein automatisierter Workflow ermöglicht eine sichere und effiziente Durchführung von Untersuchungen mit einer großen Anzahl an 3D-Zellmodellen.

Abbildung 1: Automatisiertes Arzneimittel-Screening anhand von Krebssphäroiden

Einführung

Die Bewertung der Wirkung eines Arzneimittels anhand dreidimensionaler Krebssphäroide ist wichtig, weil die Sphäroide die komplexe Mikroumgebung des Tumors in vivo viel genauer wiedergeben als zweidimensionale Modelle. Dadurch kann die Wirkung eines Arzneimittels unter ähnlichen Bedingungen wie in der Tumor-Mikroumgebung untersucht werden.

Allerdings sind die Präparation, Färbung, Bildgebung und 3D-Analyse mehrerer Proben sehr zeitaufwändig. Um diesen Prozess zu vereinfachen, haben wir die Präparation, Fixierung und Färbung von Sphäroiden mit dem CELL HANDLER System von Yamaha und die Bilderfassung und 3D-Analyse mit dem FV3000 System und der NoviSight Software automatisiert.

Vorteile

• Das CELL HANDLER System ermöglicht die Präparation von Proben ohne Probenverlust, und ohne die Zellen zu schädigen. Zudem werden Bilder der Sphäroide vor und nach dem Probentransfer aufgenommen und verschiedene Parameter analysiert, um eine vollständige Rückverfolgbarkeit gewährleisten zu können.
• Mit dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop FV3000 und der NoviSight Software lassen sich problemlos 3D-Analysen von mehreren Proben durchführen. Es können die Unterschiede der Wirkung von Arzneimitteln im Sphäroid und außerhalb des Sphäroids quantifiziert werden.

Methoden

Präparation von Krebssphäroid-Proben

Dafür wurden zunächst Sphäroide mit einem Durchmesser von 100 µm in einer ultra-haftungsarmen Mikrotiterplatte mit U-Boden kultiviert und mit 2 nM Paclitaxel (PTX) oder DMSO behandelt. Nach dreitägiger Zellkultur wurden die Sphäroide mit dem ReadyProbe Kit zur Darstellung der Zellviabilität (grün/blau) gefärbt, auf eine Platte mit Fixierlösung übertragen und damit über Nacht bei 4 ℃ behandelt. Anschließend wurden die Zellen mit dem SCALEVIEW-S4 Reagenz über Nacht bei 37 °C behandelt. Alle Probentransfers erfolgten mit einem CELL HANDLER System von Yamaha.

Bildgebung von Sphäroiden in Mikrotiterplatten und 3D-Bildanalyse

Mit dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop FV3000 wurden mehrere Fluoreszenzbilder der Sphäroide in den Platten aufgenommen. Die Bilddaten wurden an die NoviSight Software zur 3D-Zellanalyse übertragen, die lebende und tote Zellen in den 3D-Bildern erkannte und dann die Zellviabilität der Zellkultur in jedem Well genau berechnete.

Ergebnisse

Bildgebung und Analyse mit dem CELL HANDLER System von Yamaha

Das CELL HANDLER System kann Bilder und Daten zur Morphologie vor und nach dem Probentransfer erfassen. Die Bilder zeigten, dass die meisten Sphäroide erfolgreich und ohne Probenverlust übertragen wurden (Abbildung 2).

Abbildung 2: Sphäroid während der Färbung und Fixierung

Es wurde kein Unterschied zwischen den mit PTX behandelten und nicht behandelten Sphäroiden beobachtet. Andererseits zeigten Fluoreszenzsignale, dass PTX die Anzahl Lebendzellen in HT-29-Sphäroiden erheblich reduzierte, während dies in HCT-15-Sphäroiden nicht der Fall war (Abbildung 3).

Abbildung 3: Sphäroide und Zellviabilität, N = 6, **: p < 0,01, Fehlerbalken: SE

3D-Bilderfassung und -analyse mit dem FV3000 CLSM System und der NoviSight Software

Um die Wirkung von PTX auf die Mikroumgebung des Sphäroids zu analysieren, wurden die Sphäroide mit dem FV3000 Mikroskop betrachtet (Abbildung 4).

Abbildung 4: Mit dem FV3000 Mikroskop aufgenommene Bilder, blau: Zellkern (alle Zellen), rot: Zellkern (abgestorbene Zelle)

Mehrere 3D-Bilder wurden dann zur 3D-Analyse an die NoviSight Software übertragen. Diese zeigte, dass PTX die Anzahl lebensfähiger Zellen in HT-29-Sphäroiden stark reduzierte und das Sphäroid von der Mitte nach innen stark beeinträchtigte. Bei HCT-15-Sphäroiden wurde dagegen eine geringere Wirkung beobachtet (Abbildung 5).

Abbildung 5: Zellviabilität anhand 3D-Bildanalyse, N = 3~6, **: p < 0,01, Fehlerbalken: SE

Schlussfolgerung

Das CELL HANDLER System von Yamaha vereinfacht die Präparation einer großen Anzahl von Sphäroidproben. Unter Verwendung des FV3000 Mikroskops und der NoviSight Software konnten die Proben mittels 3D-Analyse einfach analysiert werden. Durch die hohe Rückverfolgbarkeit des automatisierten Prozesses wurde die Genauigkeit der 3D-Zellanalyse verbessert.

Autor

Hiroya Ishihara, Biological Engineering, Research and Development, EVIDENT