Wie alt ist der Fisch? – Einsatz eines SLIDEVIEW VS200 Objektträgerscanners für die Forschung zur anspruchsvollen Untersuchung von Fischotolithen

Einleitung

Fische der Gattung Clupea – auch Heringe genannt – spielten in der Geschichte der Fischerei im Nordatlantik eine zentrale Rolle. Anfang des 20. Jahrhunderts legte ihre Erforschung sogar den Grundstein für die Entwicklung der Fischereiwissenschaft (Abbildung 1). Diese fettreichen Fische haben zudem eine lange Geschichte als wichtiges Nahrungsmittel.

Heringe leben meist in großen Schwärmen in Küstennähe, vor allem in den flachen, gemäßigten Gewässern des Nordpazifiks und des Nordatlantiks – einschließlich der Ostsee – sowie vor der Westküste Südamerikas. Es gibt drei anerkannte Clupea-Arten, die etwa 90 % des Heringfangs ausmachen.

_{Abbildung 1. Ein Hering.}

Studien über das Alter und das Wachstum von Fischen sind wichtig, um den Zeitpunkt und das Ausmaß des Laichens, der Rekrutierung, der Lebensraumnutzung, der Larven- und Jungfischdauer und der Altersstruktur der Population zu verstehen. Dieses Wissen ist wiederum wichtig für eine angemessene Fischereipolitik. Das Alter eines Fisches kann durch Zählen der Otolithenringe bestimmt werden.

_{Abbildung 2. Otolith eines Herings.}

Die Otolithen von Fischen bilden im Laufe ihres Lebens Schichten aus Kalziumkarbonat und einer gallertartigen Matrix. Die Wachstumsrate variiert mit dem Wachstum der Fische, wobei das Wachstum im Winter in der Regel geringer und im Sommer größer ist, was zu Ringen führt, die Baumringen ähneln. Anhand der Anzahl der Ringe lässt sich das Alter des Fisches in Jahren bestimmen. Außerdem wechseln sich bei den meisten Arten Kalziumkarbonat und gallertartige Matrix in einem täglichen Zyklus ab, so dass sich das Alter eines Fisches in Tagen bestimmen lässt. Um diese für Untersuchungen zu den frühen Lebensstadien von Fischen wichtigen Informationen zu gewinnen, ist ein Mikroskop notwendig.

Experiment

Die Forscher entnahmen Otolithen, betteten sie in Acrylharz ein und schnitten sie in einer Dicke von etwa 50 μm.

Bisher wurde ein manuelles aufrechtes Mikroskop mit polarisiertem Licht verwendet, um den Otolithen zu betrachten und die Tagesringe zu zählen.

Die Sichtbarkeit der einzelnen Schichten (Ringe) ändert sich bei verschiedenen Brennpunkten, sodass diese Methode sehr zeitaufwändig ist, da die Forscher den Otolithen ständig neu fokussieren müssen.

Mit dem Olympus SLIDEVIEW VS200 Objektträgerscanner lässt sich die Aufnahme von Otolithen automatisieren und so eine Menge Zeit sparen (Abbildung 3). Das System kann für die Aufnahme eines Z-Stapels mit bis zu 31 Ebenen bei verschiedenen Vergrößerungen entweder mit polarisiertem Licht oder im Hellfeld konfiguriert werden. Bei Verwendung von Durchlicht-Hellfeld kann die motorgesteuerte Aperturblende zur Verbesserung des Kontrasts verstellt werden, indem die Apertur im Verhältnis zur numerischen Apertur des Objektivs geschlossen wird. (Abbildung 4A)

_{Abbildung 3. Der Olympus SLIDEVIEW VS200 Objektträgerscanner für die Forschung.}

Ergebnisse

Der Otolith eines jungen Fisches hat einen Durchmesser von etwa 75 μm. Der Otolith eines ausgewachsenen Fisches hat einen Durchmesser von etwa 1180 μm. Abbildung 4B wurde mit Hilfe der Polarisationsmikroskopie aufgenommen, die zur Untersuchung von Proben dient, die vor allem aufgrund ihres optisch anisotropen Charakters sichtbar sind. Der Scanner muss mit einem Polarisator im Strahlengang vor der Probe und einem Analysator (zweiter Polarisator) im Strahlengang zwischen der hinteren Objektivöffnung und der Kameraöffnung ausgestattet sein. Der Bildkontrast entsteht durch die Wechselwirkung von linear polarisiertem Licht mit einer doppelt brechenden Probe, wobei zwei einzelne Wellenkomponenten entstehen, die jeweils in zueinander senkrechten Ebenen polarisiert sind.

Wenn man sich auf die Mitte eines Otolithen konzentriert, sind die Ringe viel dichter als im äußeren Teil. Dieses Phänomen ist in den Abbildungen 5A und 5B deutlich zu erkennen. Die Bilder zeigen auch, wie wichtig es ist, Bilder in mehreren Z-Ebenen (einem Z-Stapel) aufzunehmen, da sich die Sichtbarkeit der Ringe auf verschiedenen Ebenen ändert.

Das VS200 System automatisiert die Aufnahme von Otolithen und befreit den Benutzer von der mühsamen Aufgabe der manuellen Fokussierung und Aufnahme. Da die Bilder digitalisiert sind, kann ein vollautomatisches digitales Bildanalyseprogramm erstellt werden, um die Otolithenschichten zu zählen und das Alter zu messen.

Abbildung 5A. Ein Ausschnitt aus der Mitte des Z-Stapels des Otolithen eines Jungfisches. Die einzelnen Z-Ebenen sind entsprechend ihrer Z-Position in μm dargestellt (von links oben nach rechts unten). Der Abstand zwischen den einzelnen Z-Ebenen beträgt 1,17 μm. Der Z-Stapel erstreckt sich über eine Strecke von 20 μm, und der Abstand zwischen den Otolithenschichten im mittleren Teil beträgt nur etwa 600 nm.

Abbildung 5B. Ein Ausschnitt aus der Mitte des Z-Stapels des Otolithen eines ausgewachsenen Fisches. Die einzelnen Z-Ebenen sind entsprechend ihrer Z-Position in μm dargestellt. Der Abstand zwischen den einzelnen Z-Ebenen beträgt 1,17 μm. Der Z-Stapel erstreckt sich über eine Strecke von 34 μm, und der Abstand zwischen den Otolithenschichten im mittleren Teil beträgt etwa 740 nm.

Zusammenfassung

Der SLIDEVIEW VS200 Objektträgerscanner für die Forschung bietet eine einfache und bequeme Möglichkeit, Bilder von in Harz eingebetteten Fischotolithen aufzunehmen. Bei Jungfischen beträgt der Abstand der Otolithenschichten nur etwa 600 nm, was ein Bildgebungssystem mit hoher Vergrößerung und Auflösung erfordert. Mit einem 40X UPlanXApo Objektiv mit einer NA von 0,95 liefert das VS200 System die erforderliche Vergrößerung und Auflösung.

Otolithen ausgewachsener Fische sind zudem recht dick (bis zu 34 μm) und nicht sehr transparent, da sie aus Kalziumkarbonat bestehen. Das VS200 System ist mit seinen modernen Funktionen diesen Herausforderungen gewachsen und kann qualitativ hochwertige Bilder erstellen. Bei dicken Proben kann das System die Probe in mehreren Z-Ebenen mit polarisiertem Licht scannen. Um den Kontrast in Otolithenproben zu verbessern, kann die Aperturblende des Systems geschlossen werden, um die Altersringe für eine einfache Zählung besser sichtbar zu machen.

Danksagungen

Dieses Anwendungsbeispiel wurde in Zusammenarbeit mit Dr. Bastian Huwer, National Institute of Aquatic Resources, Section for Marine Living Resources, Lyngby, Dänemark, erstellt.