Fluoreszenz-Imaging erfordert einen schwierigen Balanceakt. Einerseits muss ein ausreichend hohes Signal erfasst werden, was durch eine längere Belichtungszeit oder stärkeres Anregungslicht erreicht werden kann. Andererseits muss durch Verringerung der Anregungszeit und -intensität die Phototoxozität für die Probe minimiert werden.

Erfahren Sie, wie Sie mithilfe bester Praktiken im Umgang mit Mikroskopkameras den Mittelweg finden.

1. Verwenden Sie ein Histogramm.

Ein Histogramm kann bei der Bestimmung der idealen Belichtungszeit hilfreich sein. Ein Histogramm ist, einfach gesagt, ein Diagramm, das die Verteilung der Signalstärke anzeigt. Die x-Achse des Histogramms ist die Signalintensität. Die Daten verteilen sich zwischen Null und der maximalen Signalstärke der Kamera. Die Höhe des Histogramms bei jedem x-Wert gibt die Anzahl Pixel für die verschiedenen Signalintensitäten an, wie unten in Abbildung 1 gezeigt.

Abbildung 1: Histogramm eines Bilds. (a) Originalbild, (b) Signalintensität der einzelnen Pixel im Originalbild, (c) auf Basis des Originalbildes erstelltes Histogramm.

Form und Verteilung des Histogramms zeigen, ob die aktuelle Belichtungszeit angemessen ist. In der Mehrzahl der Fälle handelt es sich beim Fluoreszenz-Imaging bei den meisten Pixeln um dunklen Hintergrund ohne Signal, was zu einem Peak um den Hintergrundwert herum führt.

Ist das Histogramm im niedrigen Signalbereich zu überfüllt, ist die Belichtungszeit zu kurz (Abbildung 2, Mitte). Liegt bei der maximalen Signalstärke ein steiler Abfall vor, ist der Signalwert gesättigt (Abbildung 2, rechts). In diesem Fall kann die Anregungsintensität verringert oder die Belichtungszeit verkürzt werden.

Abbildung 2: Ein Histogramm für normale Belichtung (links), Unterbelichtung (Mitte) und Überbelichtung mit Sättigung beim gelben Marker (rechts).

2. Passen Sie den dynamischen Bereich der Anzeige an den dynamischen Bereich der Daten an.

Einige Bildaufnahme-Softwares verfügen über eine automatische Anzeigeanpassungsfunktion, die für eine bessere Sichtbarkeit sorgt und die ursprünglichen Bilddaten beibehält, während gleichzeitig der Zusammenhang zwischen Signalintensität und Anzeigehelligkeit definiert wird.

Durch die Anpassung des dynamischen Bereichs der Anzeige an den dynamischen Bereich der Daten (den Bereich vom Hintergrund bis zum hellsten Signal) lässt sich unter Beibehaltung der ursprünglichen Bilddaten eine bessere Sichtbarkeit erzielen (Abbildung 3, rechts). Ein Histogramm dient der Veranschaulichung dieser Anpassung.

Abbildung 3: Anpassung der Anzeige. (a) Ursprüngliche Einstellung. Die angezeigte Signalhelligkeit ist wesentlich dunkler als der dynamische Bereich der Anzeige (255). (b) Anzeigebedingungen angepasst.

Nachdem wir nun einige nützliche Hinweise und Tools für den Gebrauch von Mikroskopkameras besprochen haben, wollen wir sie in die Praxis umsetzen. In unserem nächsten Abschnitt geht es um einen einfachen schrittweisen Arbeitsablauf, der Ihnen dabei helfen kann, die optimalen Bildaufnahmeeinstellungen für das Fluoreszenz-Imaging vorzunehmen.

Einstellung der Erfassungsparameter einer Mikroskopkamera in 6 Schritten

Hier sind sechs allgemeine Schritte zur korrekten Einstellung einer Mikroskopkamera für ein Fluoreszenz-Imaging-Experiment. Beachten Sie, dass sich die optimale Vorgehensweise nach der jeweiligen Anwendung und den Proben richtet.

1. Legen Sie die Vergrößerung fest.
2. Stellen Sie die Probe scharf und lokalisieren Sie das Betrachtungsziel. Es empfiehlt sich die Anpassung der automatischen Anzeige. Schließen Sie stets den Fluoreszenz-Shutter, solange Sie kein Echtzeit-Bild betrachten oder keine Aufnahme machen.
3. Stellen Sie die Kamera für die Bildaufnahme ein (z. B. Auflösung, Belichtungszeit).
4. Versuchen Sie es mit der geringsten Anregungslichtintensität und verlängern Sie die Belichtungszeit, bis Sie ein Signal erhalten, das höher als das Hintergrundrauschen ist.
5. Wenn die Belichtungszeit unpraktikabel lang ist, probieren Sie Schritt für Schritt stärkere Anregungsintensitäten aus.
6. Überprüfen Sie das Histogramm, um sicherzustellen, dass keine Sättigung vorliegt.

Beachten Sie, dass dies lediglich eine kurze Zusammenfassung bester Praktiken ist. Ausführlichere Anweisungen zur digitalen Bildgebung finden Sie in unserem Whitepaper Zusammenhang zwischen digitalen Bilddaten und biologischen Proben.

Berücksichtigen Sie beim Fluoreszenz-Imaging stets Ihre Probe und Ihre Anwendung

Die beste Bildaufnahmeeinstellung hängt letztlich von der Probe und der Anwendung ab. Wenn Ihre Probe empfindlich ist, muss die Anregung möglicherweise sanft erfolgen. Auf der anderen Seite ist eine kürzere Belichtungszeit bei vergleichsweise starker Anregung am besten, wenn es um die Erfassung schneller Phänomene geht. So oder so kann ein Histogramm und die Anpassung der Anzeige dazu beitragen, die optimalen Aufnahmebedingungen zu bestimmen.

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