형광 이미징에는 섬세한 균형 조정이 필요합니다. 한편으로 더 긴 노출 시간이나 더 강력한 여기광을 사용하여 얻을 수 있는 충분히 높은 신호를 획득해야 합니다. 다른 한편으로 여기 시간 및 강도를 줄여 샘플 상태의 광독성을 최소화해야 합니다.
이러한 현미경 카메라 모범 사례로 균형을 유지하는 방법을 알아보십시오.
1. 히스토그램 사용.
히스토그램을 통해 최적의 노출 시간을 결정할 수 있습니다. 간단히 말해서, 히스토그램은 신호 레벨의 분포를 나타내는 도표입니다. 히스토그램의 X 축은 신호 강도입니다. 데이터는 0에서 카메라의 최대 신호 레벨까지 분포됩니다. 아래 그림 1에 표시된 바와 같이, 각 X 값에서 히스토그램의 높이는 신호 강도의 픽셀 수를 나타냅니다.
그림 1: 이미지의 히스토그램. (A) 원래 이미지, (b) 원래 이미지에 표시된 각 픽셀의 신호 강도, (c) 원래 이미지에 따라 생성된 히스토그램.
히스토그램의 모양 및 분포는 현재 노출 시간이 적절한지 여부를 알려줍니다. 대부분의 형광 이미징 사례에서 대부분의 픽셀은 신호 없는 어두운 배경이며 이는 배경 레벨 주위의 피크로 이어집니다.
히스토그램이 낮은 신호 범위에 너무 몰려 있는 경우 노출 시간이 너무 짧습니다(그림 2, 중앙). 최대 신호 레벨에 급격한 절벽이 있는 경우 신호 값이 포화됩니다(그림 2, 우측) 이 경우 여기 강도를 줄이거나 노출 시간을 단축할 수 있습니다.
그림 2: 정상 노출(좌측), 과소 노출(중앙) 및 노란색 마커에서 포화 상태의 과다 노출(우측) 히스토그램.
2. 디스플레이 동적 범위를 데이터 동적 범위에 일치시키기.
일부 이미지 획득 소프트웨어는 신호 강도와 디스플레이 밝기 간 연결을 정의하면서 더 나은 가시성을 제공하고 원래 이미지 데이터를 유지하는 자동 디스플레이 조정 기능을 가지고 있습니다.
디스플레이 동적 범위를 데이터 동적 범위(배경 레벨에서 가장 밝은 신호까지의 범위)에 일치시키면 원래 이미지 데이터를 유지하면서 더 나은 가시성을 얻을 수 있습니다(그림 3, 우측). 히스토그램이 이러한 조정을 예시합니다.
그림 3: 디스플레이 조정. (a) 원래 설정. 표시된 신호 밝기가 디스플레이 동적 범위보다 훨씬 더 어둑합니다(255). (b) 조정된 디스플레이 상태.
유용한 현미경 카메라 팁과 도구를 살펴보았습니다. 이제 실행에 옮겨보겠습니다. 다음 섹션에서는 형광 이미징을 위한 가장 적절한 이미지 획득을 설정할 수 있도록 간단한 단계별 워크플로를 소개합니다.
현미경 카메라의 획득 매개변수 설정 6단계
형광 이미징 실험을 위해 현미경 카메라를 적절히 설정하는 6가지 일반 단계가 있습니다 . 최상의 절차는 특정 용도 및 샘플에 달려 있습니다.
- 관찰 배율을 결정합니다.
- 샘플에 초점을 맞추고 관찰 대상을 찾습니다. 자동 디스플레이 조정이 권장됩니다. 라이브 이미지를 관찰하지 않고 있거나 사진을 촬영하지 않고 있는 경우 항상 형광 셔터를 닫으십시오.
- 이미지 획득을 위한 카메라 설정(예: 해상도, 노출 시간)으로 설정합니다.
- 여기광 강도를 최대한 부드럽게 하고 신호가 배경 소음보다 더 높아질 때까지 노출 시간을 늘립니다.
- 노출 시간이 비실용적으로 긴 경우 점진적으로 약간 더 강한 여기를 시도합니다.
- 포화가 없는지 히스토그램을 확인합니다.
이것이 모범 사례의 간단 목록이라는 점을 유념하십시오. 디지털 이미징에 대한 상세한 지침은 다음 백서를 참조하십시오. 디지털 이미지 데이터와 생물학적 샘플 간 링크의 이해.
형광 이미징을 위한 샘플 및 용도를 항상 고려합니다
최상의 이미지 획득 설정은 궁극적으로 샘플 및 용도에 달려 있습니다. 샘플이 상하기 쉬운 경우 부드러운 여기를 사용해야 할 수 있습니다. 반면에 빠른 현상을 캡처해야 할 경우 비교적 강한 여기로 더 짧은 노출을 적용하는 것이 가장 좋을 수 있습니다. 어느 쪽이든, 히스토그램과 디스플레이 조정을 통해 최상의 획득 상태를 결정할 수 있습니다.
