Todos los años Nature Methods revisa las tecnologías y enfoques que han hecho avanzar la industria de las ciencias de la vida durante el año anterior y después selecciona las más populares e influyentes. En 2017 Nature Methods nombró a los organoides como el método del año. Desde entonces la investigación con organoides ha dado sus frutos gracias a los infatigables esfuerzos de numerosos investigadores.
Dicho de manera sencilla, los organoides son cultivos tisulares tridimensionales (3D) que pueden derivarse de tejido o de células madre. Los organoides se utilizan para una amplia gama de investigaciones, ya que básicamente son versiones simplificadas y en miniatura de tejidos u órganos humanos. Se asemejan en gran medida a la estructura y la función fisiológicas de los tejidos in situ y pueden mantener la información genética en numerosos pasajes de forma estable.
Gracias a su capacidad de simular partes del cuerpo humano los investigadores utilizan los organoides para:
- Obtener información sobre el proceso de desarrollo de los órganos.
- Probar el funcionamiento de los fármacos.
- Desarrollar terapias regenerativas.
En esta publicación del blog vamos a explorar algunas de las últimas investigaciones sobre organoides y compartir cómo los sistemas de procesamiento de imágenes permiten avanzar en este importante trabajo.
Avances en la investigación con organoides
Los investigadores siguen produciendo investigaciones nuevas utilizando organoides. A continuación, se mencionan algunos estudios eminentes:
1. Patient-Derived Glioblastoma Organoid Model and Biobank Recapitulates Inter- and Intra-tumoral Heterogeneity
En 2019 investigadores de la University of Pennsylvania publicaron un artículo titulado «A Patient-Derived Glioblastoma Organoid Model and Biobank Recapitulates Inter- and Intra-tumoral Heterogeneity» en Cell. En este artículo se informaba acerca del establecimiento de un modelo y biobanco de organoides de glioblastomas (GBO, por sus siglas en inglés) derivado de pacientes.
En el estudio se demostró que los GBO retienen las características clave de los glioblastomas y que se pueden utilizar inmediatamente para desarrollar estrategias de tratamiento para los pacientes. El biobanco creado por los investigadores ofrece numerosos recursos para estudios básicos y traslacionales de glioblastomas.
Los investigadores documentaron el proceso de crecimiento y los cambios morfológicos de los organoides observados bajo un microscopio. También observaron los patrones de expresión de algunos marcadores de proteínas en los organoides usando microscopía de escaneo láser confocal.
En este trabajo se demostró la heterogeneidad aparente en la morfología y características de las células organoides, así como su composición celular muy similar a la de los tumores parentales.
2. Chromatin Accessibility Dynamics in a Model of Human Forebrain Development
En 2020 se publicó el artículo titulado «Chromatin accessibility dynamics in a model of human forebrain development» en Science. En este artículo los investigadores describieron el proceso para crear el cultivo y el uso previsto de organoides del prosencéfalo humano. Demostraron que los organoides del prosencéfalo humano pueden ensamblarse por sí solos en diferentes partes del prosencéfalo.
Lo que es más emocionante es que los investigadores encontraron una forma de prolongar la vida de los organoides del prosencéfalo humano hasta los 300 días. Es tiempo suficiente para observar el desarrollo de los organoides del prosencéfalo en estructuras más complejas.
3. Amplification of Human Interneuron Progenitors Promotes Brain Tumors and Neurological Defects
En 2022 se publicó en Science el artículo «Amplification of human interneuron progenitors promotes brain tumors and neurological defects». En este estudio se revelaron los procesos de desarrollo específicos de los humanos responsables de las malformaciones del desarrollo cortical (MDC), que pueden causar retrasos en el desarrollo y epilepsia en niños.
Los investigadores establecieron un modelo de organoides del cerebro humano para el complejo de esclerosis tuberosa (CET) e identificaron un tipo de células madre neuronales específicas, los progenitores de interneuronas caudales tardías (CLIP, por sus siglas en inglés). En el CET, las células CLIP proliferan en demasía, y se produce un exceso de interneuronas, tumores cerebrales y malformaciones corticales.
Los organoides son modelos prometedores para estudiar el desarrollo, las enfermedades y los fármacos. Asimismo, presentan buenas posibilidades en otros campos, como la medicina regenerativa. No obstante, quedan muchos retos en el cultivo, la observación y el análisis de datos cuantitativos de organoides, ya que sus condiciones y estructuras de cultivo son más complejas que las de las células fijadas.
3 formas en las que el procesamiento de imágenes de microscopio han hecho avanzar la investigación con organoides
Por suerte, los equipos de procesamiento de imágenes con microscopio pueden ayudar con estos retos. Aquí se detallan las 3 formas en las que los sistemas de procesamiento de imágenes con microscopio y el software hacen avanzar la investigación con organoides:
1. Control de calidad en el cultivo de organoides
El método de preparación típico de los organoides es el aislamiento de las células embrionarias o células madre pluripotentes, y después se cultivan estas células en medios de soporte (como Matrigel) para permitir el crecimiento en tres dimensiones.
Las citoquinas, los factores de crecimiento y las moléculas pequeñas se añaden al medio para activar o inhibir vías de señalización específicas implicadas en la formación de los organoides. Las vías de señalización son las mismas que las que intervienen en el desarrollo y mantenimiento de la homeostasia de los órganos equivalentes in vivo.
De acuerdo con la investigación del Dr. Takanori Takebe del Tokyo Medical and Dental University Institute of Research, la eficiencia de la diferenciación posterior en organoides resulta afectada en gran medida por las diferencias en la etapa temprana de proliferación durante el cultivo de mantenimiento. Observó que en las líneas celulares iPS capaces de diferenciarse las colonias se formaron a partir de la mayoría de las células individuales adheridas tras el pasaje en la etapa temprana de proliferación.
El Dr. Takebe se planteó la hipótesis de que la mayor frecuencia de muerte celular en las primeras etapas del cultivo de mantenimiento a partir de líneas celulares iPS resistentes a la diferenciación provoca una menor cantidad de colonias de células iPS, lo que en última instancia disminuye su eficiencia de diferenciación en organoides hepáticos. Como consecuencia, la formación reproducible de organoides precisa el desarrollo de protocolos más óptimos para la diferenciación de organoides, así como la optimización de cultivos para las células iPS originales no diferenciadas. Con el fin de adquirir nuevas perspectivas y mejorar los protocolos experimentales, el Dr. Takebe utiliza nuestro sistema de monitorización de incubación.
Mediante el uso del sistema CM30 para la adquisición y análisis de datos con lapso de tiempo de muestras cultivadas, los investigadores pueden comprender el estado de las células iPS durante el cultivo celular e identificar factores clave para aumentar la eficiencia de la diferenciación y mejorar aún más los protocolos experimentales.
Dado el prolongado tiempo de cultivo de los organoides y el elevado coste de los medios y aditivos necesarios para mantener su crecimiento, los investigadores deben prestar especial atención al proceso de cultivo de los organoides y su crecimiento, así como a la prevención de la contaminación.
Gracias a la monitorización a distancia del sistema CM30 no es necesario entrar en la sala blanca para sacar las muestras de la incubadora y examinarlas en el microscopio. Esto incrementa considerablemente la eficiencia experimental y reduce el riesgo de contaminación.
Desarrollo de organoides en una incubadora. Imágenes capturadas utilizando el sistema de monitorización de incubación CM. Datos de imagen por cortesía de ACEL, Inc.
2. Procesamiento de imágenes de microscopio de organoides
Debido a que los organoides son cultivos celulares 3D con un cierto volumen, se prefieren los dispositivos para el procesamiento de imágenes de microscopio que puedan adquirir información de imágenes del eje Z multicapas para el procesamiento de imágenes 3D. Esta capacidad le permite obtener una información exhaustiva de las características morfológicas y las estructuras celulares internas de los organoides en el procesamiento de imágenes.
Microscopía de escaneo láser confocal para el procesamiento de imágenes de organoides
Los microscopios de escaneo láser confocal son adecuados para la adquisición de imágenes volumétricas 3D de un organoide. Gracias al estenopo situado en la parte delantera del detector que bloquea el fondo desenfocado, solo se captura la información en la profundidad deseada con una resolución axial elevada.
Nuestro microscopio de escaneo láser confocal FLUOVIEW™ FV4000 integra el procesamiento de imágenes preciso con nuestro detector SilVIR™, que permite una elevada relación señal-ruido, un procesamiento de imágenes más preciso y y una resolución elevada especial y espectral. El detector SilVIR utiliza nuestra tecnología patentada* para permitir un recuento de fotones de alto rango dinámico para obtener datos precisos de procesamiento de imágenes 3D. La tecnología también permite reconstruir imágenes 3D precisas, que es ideal para la investigación de las estructuras de los organoides.
*Número de patente US11237047.
El sistema FV4000 también ofrece una solución probada de infrarrojo cercano (NIR). El procesamiento de imágenes con NIR ofrece una penetración profunda, baja fototoxicidad e interferencia baja de la autoflorescencia de tejidos. La consecuencia es que trabaja con varios contrastes fluorescentes en el rango visible para el procesamiento de imágenes de fluorescencia multicromática de organoides sin comunicación cruzada con el potencial de monitorización a largo plazo de la actividad de los organoides.
Observación continua de cultivos de células esferoides 3D durante 21 días utilizando el microscopio de escaneo láser confocal FLUOVIEW. El núcleo está marcado con SYTOX Orange (rojo). El citoesqueleto está marcado con Alexa Fluor 488 (verde).
Microscopía multifotónica para el procesamiento de imágenes de organoides
Para obtener una imagen completa de un organoide con un gran volumen, hay una demanda más rigurosa de profundidad en el procesamiento de imágenes. Los microscopios multifotónico son sistemas para el procesamiento de imágenes con microscopio adecuadas para el procesamiento de imágenes profundo de los organoides.
Aquí se ve una vista general de cómo estos sistemas pueden ayudar con el procesamiento de imágenes profundo de organoides:
Nuestro microscopio multifotónico FV4000MPE tiene un diseño óptico avanzado para optimizar la sensibilidad y la resolución en el procesamiento de imágenes profundo. Un rango de longitud de onda de 400–1600 nm apoya una excitación de la radiación infrarroja más eficiente sin comprometer la detección de la longitud de onda visible.
Su ruta óptica de detección con una apertura clara grande y elevada eficiencia apoya el mezclado de más señales de emisión, en especial los fotones dispersos en ángulos incidentales grandes. Asimismo, el detector SilVIR en el centro del sistema ofrece un ruido excepcionalmente bajo y sensibilidad elevada con una relación elevada señal-ruido en todo el rango de longitud de onda de visible a cercano al infrarrojo.
Estas capacidades ópticas le permiten capturar información más profunda de un organoide. Los objetivos TruResolution™ mejoran la luminosidad y la resolución del procesamiento de imágenes profundo con compensación automática de la aberración esférica. Estos dispositivos ópticos de alto rendimiento adquieren información más detallada en una imagen 3D para capturar a todos los niveles.
Microscopía de superrresolución para el procesamiento de imágenes de organoides
En el caso de organoides con un gran volumen, el sistema de procesamiento de imágenes está sometido a demandas superiores. El sistema de procesamiento de imágenes debe adquirir imágenes de la pila Z y unir las imágenes adquiridas, lo que requiere la adquisición de imágenes de alta velocidad. Aquí donde entra en juego la microscopía confocal de disco giratorio.
Mientras que los microscopios de escaneo láser utilizan un solo estenopo, los microscopios confocales de disco giratorio utilizan un disco opaco con cientos de estenopos que giran a altas velocidades. Toda la muestra se adquiere de una vez, en lugar de punto a punto, lo que aumenta considerablemente la velocidad de procesamiento de imágenes y reduce el fotodaño.
Nuestro microscopio de superresolución IXplore™ SpinSR es un sistema confocal con disco giratorio que incorpora procesamiento rápido de imágenes, alta sensibilidad, baja fototoxicidad y módulos con superresolución escalables con resoluciones de casi 120 nm. Estas capacidades ayudan en el procesamiento rápido de imágenes de la pila Z y la unión de imágenes de organoides.
Sistema de microscopio de súperresolución IXplore SpinSR.
El sistema IXplore SpinSR trabaja también con nuestra serie de objetivos en aceite de silicona. Estos dispositivos ópticos permiten imágenes nítidas de superresolución con menos borrosidad en el procesamiento de imágenes profundo de organoides.
Nuestros objetivos en aceite de silicona utilizan un aceite de silicona especial con un índice refractivo de 1,40 como el medio de inmersión. Esto satisface los requisitos para adquirir imágenes de alta resolución (superior a los objetivos de inmersión e agua) y observar muestras muy dispersas, como los organoides y otras muestras gruesas.
3. Análisis cuantitativo de las imágenes de organoides
Hasta ahora hemos analizado cómo puede adquirir imágenes macro y micro claras de organoides en las que se utiliza equipo de procesamiento de imágenes de microscopios de alta calidad, como microscopios de escaneo láser confocal, multifotónicos y de superresolución. Estas imágenes hacen posible que los investigadores observen la estructura fina de cada célula o incluso del nivel subcelular dentro de una muestra 3D.
Para los investigadores de ciencias de la vida no es suficiente con solo observar los detalles de una muestra. En experimentos en los que se utilizaron modelos de organoides para la validación de la eficacia y el análisis toxicológico de fármacos, son necesarios análisis cualitativos y cuantitativos de la morfología del organoide y sus células internas. Por ejemplo, al comparar las diferencias entre múltiples organoides en concentraciones diferentes de dosificación del fármaco en una placa de múltiples pocillos pueden ofrecer datos estadísticos más convincentes.
Con el fin de satisfacer estas necesidades de aplicación, hemos desarrollado el software de análisis celular NoviSight™ para la identificación de células 3D complejas y el análisis de muestras, como células esferoides u organoides cultivados en placas de múltiples pocillos.
Interfaz del usuario del software NoviSight. En este ejemplo se muestra un análisis cuantitativo de células mitóticas dentro de células esferoides tratadas con diferentes concentraciones de paclitaxel.
A continuación se indican algunas de sus útiles características para la investigación de organoides:
- La exclusiva tecnología de análisis celular True 3D puede ayudar a reproducir de forma realista la morfología espacial de sus muestras.
- El módulo de medición multiparamétrica puede ayudarle a identificar con rapidez los componentes de los organoides y las células y obtener datos útiles, como el volumen, el área superficial, la distancia espacial y la intensidad de la fluorescencia.
- La interfaz del usuario interactiva le permite emparejar fácilmente imágenes de células con sus estadísticas para el análisis estadístico exacto de los datos.
Dado que los organoides se pueden utilizar para simular en gran medida los tejidos humanos correspondientes en el nivel genético y morfológico, hay grandes expectativas de aplicación en la simulación del proceso de desarrollo, la investigación de enfermedades, la inmunidad clínica, la sensibilidad a los fármacos de los tumores, la medicina regenerativa y la medicina de precisión.
A pesar de esto, es importante recordar que los organoides siguen siendo una tecnología emergente. Existen limitaciones en el cultivo, el control de la calidad y la reproducibilidad experimental de los organoides. Queda mucho por hacer en la investigación básica, la aplicación y la traslación de los organoides.
Evident, que cuenta con una prolongada historia en óptica y microscopía, está comprometido con el apoyo a investigadores de organoides a través de su proceso experimental. Al ofrecer soluciones completas para la investigación de organoides, desde la preparación de las muestras hasta la adquisición y el análisis de datos 3D, contribuimos en nuestra misión de hacer del mundo un lugar más sano y seguro.
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