Prueba de viabilidad de medicamentos en esferoides tumorales 3D con el procesamiento de imágenes automatizado de nivel macro a micro

Descripción

La observación microscópica es una forma efectiva de evaluar los efectos medicinales de los medicamentos anticancerosos (o contra el cáncer) en esferoides u organoides. Sin embargo, el flujo del procesamiento de imágenes puede requerir mucho tiempo, ya que se debe estar delante del microscopio hasta encontrar la muestra idónea y adquirir las imágenes.

Nuestra empresa ha desarrollado un procesamiento de imágenes automatizado de nivel macro a micro: un innovador módulo de procesamiento de imágenes que mejora drásticamente la eficiencia de este proceso. El procesamiento de imágenes automatizado de nivel macro a micro permite reemplazar las operaciones microscópicas manuales con la adquisición de imágenes y detección de objetos, ambas de forma automática. A través de esta nota de aplicación, se presenta un estudio de caso relativo al ensayo de viabilidad de los medicamentos anticancerosos en esferoides tumorales 3D mediante un procesamiento de imágenes automatizado de nivel macro a micro.

Materiales y métodos: Preparación de las muestras

Se cultivaron células de la línea celular de cáncer de mama humano MCF-7 a razón de 2000 células/pocillo en una placa U de 96 pocillos (PrimeSurface, Sumitomo Bakelite). En el tercer día de cultivo, se agregaron medicamentos anticancerosos (Paclitaxel, 5-FU, Cisplatino) en diversas concentraciones. Tras 24 horas de cultivo, se agregaron los siguientes compuestos: Hoechst 33342, yoduro de propidio (PI) y calceína AM. Y, se determinó un período de incubación de una hora. Los núcleos de todas las células se tiñeron con el compuesto Hoechst33342, los núcleos de las células muertas se tiñeron con yoduro de propidio y las células vivas se tiñeron con calceína AM. Después, se observaron las células usando el módulo de software automatizado de nivel macro a micro en el microscopio de escaneo láser confocal FV3000 de Olympus.

¿Cómo funciona el procesamiento de imágenes automatizado de nivel macro a micro?

Por medio del procesamiento de imágenes automatizado de nivel macro a micro, las siguientes operaciones pueden llevarse a cabo de forma automática y con sólo configurar los métodos de observación anticipadamente.

En primer lugar, el procesamiento de imágenes de nivel macro a micro adquiere una imagen general de todo el pocillo (incluido el eje Z) con una lente de objetivo de baja magnificación (objetivo de 1.25X a 4X). En función de la imagen obtenida (imagen de nivel macro), la posición y el espesor de la muestra son detectados automáticamente en cada pocillo. A continuación, se calcula la posición óptima de captura de imagen (XYZ) y se adquieren imágenes detalladas de la muestra con una lente de objetivo de alta magnificación (imagen de nivel micro o microimagen). Si la muestra es más grande que el campo visual de la lente de objetivo usada en la microimagen, el sistema es capaz de unir automáticamente varias imágenes (Figura 1).

Figura 1. Imagen esquemática de nivel macro a micro
 

La operación del microscopio dura entre 15 y 20 minutos y sólo es necesaria cuando se determinan los métodos de observación iniciales. Durante la ejecución del procesamiento de imágenes automatizado de nivel macro a micro, el usuario puede dejar el microscopio y el PC para proseguir con otras tareas mientras finaliza el procesamiento de imágenes. Como resultado, el tiempo dedicado a operar el microscopio se reduce de forma radical. Por otra parte, a pesar de que el espesor o la posición de las muestras varían entre los pocillos, el sistema es capaz de capturar imágenes dotadas de un óptimo rango Z en cada muestra. Esto agiliza el tiempo del procesamiento de imágenes y reduce la cantidad de datos de imágenes.

Etapas del procesamiento de imágenes de nivel macro a micro

Resultados de imágenes

Los esferoides MCF7 tratados con varios medicamentos anticancerosos fueron teñidos con calceína AM y PI para visualizar la viabilidad. Al usar el módulo de procesamiento de imágenes automatizado de nivel macro a micro con el microscopio confocal FV3000, se pudieron obtener rápidamente imágenes de alta resolución a partir de 60 pocillos capturados desde las posiciones adecuadas. La operación del microscopio tomó solamente 15 minutos (Figura 2).

Figura 2. Adaptación del módulo de procesamiento de imágenes automatizado de nivel macro a micro para una prueba de viabilidad de medicamentos anticancerosos
 

El proceso convencional de observación requiere que se especifique la posición de la muestra, a razón de un pocillo a la vez, para lograr las condiciones de procesamiento de imágenes adecuadas. Pero, si se usa el módulo de procesamiento de imágenes automatizado de nivel macro a micro es usado, este trabajo deviene obsoleto. Además, el tiempo dedicado al procesamiento de imágenes puede usarse en otras tareas, lo que fomenta la eficiencia de su investigación.

Resultados analíticos

Si los archivos de las imágenes adquiridas por medio del módulo de procesamiento de imágenes automatizado de nivel macro a micro, se abren con el software de análisis celular 3D NoviSight™, es posible analizar tridimensionalmente varias imágenes provenientes de multiples pocillos a la vez.

Todos los núcleos fueron reconocidos por la intensidad del componente Hoechst33342 en los esferoides MCF7. La viabilidad fue evaluada por medio de la categorización de los núcleos reconocidos, es decir que según la intensidad de la calceína AM y el PI se reconocía si los núcleos eran células vivas o muertas. Por consiguiente, se pudo evaluar con éxito la viabilidad de cada medicamento anticanceroso a nivel de una sola célula, en conformidad con los informes conocidos (Figura 3 y Figura 4).

Figura 3. Análisis de NoviSight para la clasificación de células vivas/muertas usando la intensidad de la calceína y el PI.
 

Figura 4. Resultados de la viabilidad de los esferoides mediante el análisis del software NoviSight
 

Conclusión

Con el módulo de procesamiento de imágenes automatizado de nivel macro a micro, se pudieron capturar 60 pocillos a partir de una microplaca a través de posiciones de imagen apropiadas, después de aproximadamente 15 minutos de haber operado el microscopio y el/la PC.

Se previó que la obtención manual de imágenes de un pocillo a la vez requeriría más de seis horas de operación intermitente en el microscopio y el/la PC, considerando también el tiempo del procesamiento de imágenes. Gracias al módulo de imágenes automatizado, solo se necesitó pasar unos 15 minutos operando el microscopio y el/la PC, además de contar con la flexibilidad para llevar a cabo otras tareas mientras el procesamiento finalizaba.

Además, al combinar el procesamiento de imágenes automatizado de nivel macro a micro y el software NoviSight, las imágenes de múltiples pocillos podrían analizarse en lotes. Esta configuración permite un flujo de trabajo continuo desde la adquisición de imágenes hasta el análisis de muestras de esferoides a partir de múltiples pocillos.
 

Mayu Ogawa
Investigador, Departamento de I+D, Olympus Corporation