El procesamiento de imágenes biológico fluorescente es una técnica utilizada ampliamente para visualizar fenómenos biológicos. Frecuentemente, se usan las proteínas fluorescentes y los puntos cuánticos como fluorocromos para esta finalidad, mientras que la luz visible suele ser la fuente de excitación. Sin embargo, la alta energía de la luz de onda corta, como la luz visible, tiene efectos no deseados cuando se compara con la luz infrarroja cercana (NIR) de longitud de onda superior:
- Más fotoblanqueamiento
- Mayor fototoxicidad en las muestras biológicas
- Profundidad de penetración limitada debido a una mayor dispersión
El procesamiento de imágenes con conversión ascendente es una técnica de observación que adquiere fluorescencia visible mediante la excitación de la luz infrarroja cercana (NIR). En los últimos años, ha atraído bastante interés, ya que ofrece un método viable para superar los problemas mencionados anteriormente con respecto al procesamiento de imágenes usando fluorescencia.
¿Qué es la conversión ascendente?
La conversión ascendente es el fenómeno de excitación mediante longitudes de onda superiores, como la luz infrarroja cercana y la emisión de una luz de onda más corta (visible o luz ultravioleta) que la luz de excitación.
El procesamiento de imágenes con nanopartículas de conversión ascendente (UCNP, sigla en inglés) usa un láser diodo de onda continua para la excitación y la excitación multipaso por irradiación de la luz infrarroja cercana para emitir luz visible de onda corta y de alta energía.
Figura 1. Diagrama conceptual de la conversión ascendente de fotones
¿Cuáles son las ventajas del procesamiento de imágenes de conversión ascendente?
En el procesamiento de imágenes de fluorescencia con UCNP se usa un láser de longitud de onda NIR (808 nm, 980 nm, etc.) para la excitación; éste permite un procesamiento de imágenes más profundo en los tejidos y organismos con menos dispersión. Asimismo, dado que la luz con una longitud de onda superior presenta menos energía, ésta causa menos daños en el organismo en comparación con la excitación con luz visible de energía superior. Las UCNP son muy estables y no sufren fácilmente el fotoblanqueo; esto hace que sean adecuadas para el procesamiento de imágenes de células y organismos vivos.
Por otra parte, la excitación para la conversión ascendente se puede lograr con un láser de diodo de onda continua en lugar de un láser pulsado de alta potencia. Esto permite a los investigadores llevar a cabo experimentos en la óptima ventana* óptica biológica NIR con la simplicidad de un sistema microscópico confocal, en lugar de usar un sistema microscópico multifotónico más complejo y caro.
Figura 2. Ejemplo del microscopio confocal de la serie FLUOVIEW™ con una unidad de introducción láser para la conversión ascendente
Ejemplos de las aplicaciones en las que la conversión ascendente puede usarse:
- Liberación de compuestos atrapados
- Activación de canales iónicos
- Estimulación nerviosa
- Transferencia de energía de resonancia luminiscente (LRET)
Figura 3. Larvas de pez cebra, cinco días después de la fertilización.
Las células de los gliomas U87 se coincubaron con UCNP recubiertas de 5 μg/ml de ácido colomínico durante 12 horas, siendo inyectadas en larvas de pez cebra cinco días después de la fertilización y distribución de nanopartículas identificadas en el pez cebra.
Canal verde: GFP expresado en las células endoteliales del pez cebra transgénico
Canal rojo (UCNP): Cubierta proteica de 70 nm NaYbF4:Tm@NaYF4 nanopartículas recubiertas por DSPE-PEG, ningún otro marcado
Imagen por cortesía del Dr. Yiqing Lu, Escuela de ingeniería, Universidad Macquarie.
Soluciones para la conversión ascendente de EVIDENT
Evident ofrece sistemas microscópicos confocales de escaneo láser que favorecen el procesamiento de imágenes con conversión ascendente. Podemos proponer una solución personalizada a sus experimentos, cubriendo el tipo y el número de láser.
Contacte con su distribuidor local si tiene dudas o para solicitar una cotización.
* Ventana óptica biológica: Rango de longitud de onda cercana al infrarrojo (650 nm–1000 nm) en el que la luz penetra fácilmente en los organismos vivos.
Referencias
▸Na Ren, Na Liang, Xin Yu, Aizhu Wang, Juan Xie, Chunhui Sun. Ligand-free upconversion nanoparticles for cell labeling and their effects on stem cell differentiation. Nanotechnology. 2020 Apr 3;31(14):145101.
▸Yanxiao Ao, Kanghua Zeng, Bin Yu, Yu Miao, Wesley Hung, Zhongzheng Yu, Yanhong Xue, Timothy Thatt Yang Tan, Tao Xu, Mei Zhen, Xiangliang Yang*, Yan Zhang, and Shangbang Gao. An Upconversion Nanoparticle Enables Near Infrared-Optogenetic Manipulation of the Caenorhabditis elegans Motor Circuit. ACS Nano 2019, 13, 3, 3373–3386.
▸Yong-Xiang Wu, Xiao-Bing Zhang, Dai-Liang Zhang, Cui-Cui Zhang, Jun-Bin Li, Yuan Wu, Zhi-Ling Song, Ru-Qin Yu, Weihong Tan. Quench-Shield Ratiometric Upconversion Luminescence Nanoplatform for Biosensing. Analytical Chemistry 2016, 88, 3, 1639–1646.
