Systèmes de balayage pour les microscopes confocaux

L’imagerie confocale repose sur la collecte séquentielle de la lumière de points d’échantillon individuels filtrés spatialement, suivie d’un traitement électronique du signal et, enfin, de l’affichage des points d’image correspondants. Le processus de collecte des signaux point par point nécessite un mécanisme permettant de balayer le volume d’échantillon observé avec le faisceau lumineux focalisé. Trois principales variantes de balayage sont couramment utilisées pour produire des images en microscopie confocales. Un fonctionnement confocal fondamentalement équivalent peut être obtenu en utilisant une platine porte-échantillon à translation latérale couplée à un faisceau lumineux fixe (balayage par déplacement de la platine), un faisceau lumineux qui balaye une platine fixe (balayage par déplacement du faisceau), ou en maintenant la platine et la source lumineuse stationnaires pendant le balayage de l’échantillon avec un réseau de points lumineux transmis par les ouvertures d’un disque rotatif Nipkow, également désigné par le terme de disque rotatif (voir les figures 1 et 2). Chaque technique présente des caractéristiques de performance qui la rendent avantageuse pour certaines applications confocales, mais qui en limitent l’utilité dans d’autres.

Les configurations de balayage par déplacement de la platine et de balayage par déplacement du faisceau sont des méthodes à faisceau unique, tandis que l’approche par disque rotatif est une technique de balayage multifaisceau. Les systèmes utilisant le concept du balayage au moyen d’un disque de Nipkow ont généralement utilisé des sources lumineuses à large spectre non cohérentes (comme les lampes à arc) pour l’éclairage plutôt que des lasers, et le manque global de luminosité a considérablement limité leur utilisation dans les applications d’imagerie de fluorescence. Cependant, les réseaux de microlentilles modernes et les améliorations sophistiquées dans la conception des disques, associés à un éclairage laser, ont élargi les applications potentielles pour les microscopes confocaux à disque rotatif. Les systèmes à disques de Nipkow peuvent être conçus soit en version balayage en tandem, soit en version balayage monofaisceau. Dans la première version, les faisceaux d’éclairage et de détection suivent des trajets en tandem à travers des ensembles distincts d’ouvertures identiques situées sur les côtés diamétralement opposés du disque. Le système de balayage monofaisceau effectue quant à lui l’éclairage et la détection simultanément à travers chaque ouverture du disque rotatif en maintenant la coïncidence des deux trajets optiques lors du passage dans l’objectif.

Une autre méthode de balayage monofaisceau a fait l’objet d’une application limitée dans les microscopes à lumière réfléchie spécialisés, principalement pour l’inspection de circuits intégrés. L’objectif lui-même peut être utilisé pour effectuer le balayage sur un échantillon stationnaire avec une source lumineuse stationnaire dans un système à balayage par déplacement de l’objectif. Cette configuration présente des avantages optiques similaires à ceux du balayage par déplacement de la platine, mais permet d’installer des sondes de mesure sur l’échantillon stationnaire ou de le manipuler par d’autres moyens. Cette configuration n’est pas adaptée à un balayage rapide lorsqu’un objectif conventionnel relativement gros est utilisé, et elle n’est donc pas très utilisée.

Le microscope confocal moderne est un système électronique intégré, le plus souvent basé sur un microscope à épifluorescence à champ large, avec l’adjonction de plusieurs sources d’éclairage laser, d’une tête de balayage équipée de composants électroniques et optiques, d’un ordinateur et d’un écran pour l’affichage des images, ainsi que de logiciels associés pour le contrôle de l’acquisition et du traitement des signaux et l’analyse des images. Dans la configuration optique confocale de base, l’objectif forme une image des sténopés de la source et du détecteur sur le plan de l’échantillon. En positionnant les sténopés sur l’axe optique du microscope dans des plans focaux conjugués, leurs images se chevauchent dans le plan focal au niveau de l’échantillon. Bien que les fluorophores en dehors du plan focal soient excités, la détection est limitée à l’émission qui se produit près du plan focal par l’ouverture du sténopé du détecteur, qui rejette la lumière non focalisée. Le microscope confocal à balayage laser monofaisceau fonctionne dans ce mode de balayage point par point comme un dispositif d’échantillonnage et ne forme pas d’image optique (réelle). Pour permettre la formation d’une image, le point d’échantillonnage doit être déplacé à travers l’échantillon et le signal obtenu doit être recueilli et stocké. La tête de balayage contrôle la production du signal photonique nécessaire pour construire l’image confocale. Les composants d’une tête de balayage typique du commerce sont illustrés à la figure 1. Ils comprennent généralement une ou plusieurs entrées laser, des jeux de filtres de fluorescence, un mécanisme de balayage ligne par ligne, des ouvertures de sténopé variables et des détecteurs (généralement des tubes photomultiplicateurs, ou PMT en anglais) pour la détection de plusieurs longueurs d’onde de fluorescence.

Pour étendre le principe de l’échantillonnage confocal point par point afin de permettre la génération d’un champ d’image de l’échantillon étendu, le point focal dans l’échantillon est déplacé de façon à balayer l’échantillon selon un motif ligne par ligne semblable à celui utilisé pour créer l’image sur un écran de télévision (ainsi que dans d’autres applications vidéo ; voir la figure 2(a)). Ce mécanisme nécessite un balayage horizontal rapide (balayage linéaire) associé à un balayage vertical plus lent, ou balayage de trame d’image, qui décale la ligne de balayage en positions séquentielles de haut en bas de l’image. Au cours de l’histoire du développement des microscopes confocaux, un certain nombre de techniques différentes ont été employées pour mettre en œuvre le balayage point par point, et plusieurs ont été affinées pour devenir les versions que l’on trouve dans le commerce actuellement. Dans les microscopes à balayage laser monofaisceau, un mécanisme de balayage ligne par ligne type utilise deux miroirs oscillants à grande vitesse entraînés par des moteurs galvanométriques, qui pivotent sur des axes perpendiculaires l’un à l’autre. La coordination des deux miroirs, l’un effectuant un balayage le long de l’axe X et l’autre le long de l’axe Y, produit le balayage rectiligne ligne par ligne. La vitesse de balayage des miroirs est négligeable par rapport à la vitesse de la lumière et, par conséquent, la fluorescence émise peut être captée par l’objectif et renvoyée le long du trajet d’éclairage initial jusqu’à son plan focal conjugué au niveau du sténopé du détecteur. La variation de l’intensité du signal éclairant l’ouverture du détecteur correspond aux variations d’émission aux différents points de l’échantillon à mesure du déplacement du faisceau d’excitation.

Plusieurs caractéristiques d’un système de balayage confocal idéal, nécessaires pour fournir des performances d’imagerie optimales, sont extrêmement difficiles à réaliser en pratique. Presque toutes les configurations de système de balayage présentent des lacunes de fonctionnement, et diverses modifications de la conception optique et électronique ont été introduites pour tenter de corriger ces lacunes. Plusieurs méthodes de mise en œuvre du balayage point par point réduisent la sensibilité ou impliquent d’importants compromis quant à la flexibilité ou la qualité d’image et ne sont actuellement pas utilisées dans les systèmes du commerce. L’une des conditions les plus importantes pour la conception du système de balayage est que la pupille de l’objectif (ouverture focale arrière) soit complètement inondée de lumière pendant tout le cycle de balayage afin d’éviter une baisse de l’éclairage aux points extrêmes du balayage. Pour ce faire, il est préférable de minimiser le mouvement du faisceau au niveau de l’ouverture grâce à une conception de balayage qui fait pivoter le faisceau à un point fixe conjugué à l’ouverture arrière de l’objectif. Il est techniquement difficile de maintenir un point de pivot fixe lorsque le faisceau est balancé pendant le balayage, et certains systèmes compensent un léger mouvement du faisceau en remplissant l’ouverture par une étendue accrue du faisceau. Cela présente l’inconvénient de gaspiller de la lumière et de réduire l’efficacité des photons du système.

Une autre propriété souhaitable du mécanisme de balayage confocal consiste à effectuer un balayage à la fréquence d’images la plus élevée possible afin d’avoir la flexibilité de pouvoir utiliser différents modes de balayage pour s’adapter à l’application d’imagerie utilisée. Cela nécessite une inertie minimale des composants mobiles responsables du déplacement du faisceau lors du balayage ainsi que la réduction du temps mort du système (c’est-à-dire l’intervalle entre chaque cycle de balayage) durant lequel le faisceau ne balaye pas l’échantillon. La proportion de chaque intervalle de balayage plein cadre utilisé pour effectivement balayer l’échantillon est appelée cycle de service du système. La réduction au minimum du balayage non productif par le faisceau est non seulement essentielle pour obtenir une fréquence d’images élevée, mais dans certains modèles d’instruments, réduit la dégradation inutile de l’échantillon par les photons, qui résulte d’une mauvaise spécification du cycle de service.

La possibilité de faire pivoter librement la trame de balayage autour de l’axe optique est une propriété très importante pour l’imagerie confocale comme moyen d’optimiser la direction du balayage en fonction de la forme de l’échantillon ou d’autres caractéristiques. Lors de l’acquisition d’images d’éléments allongés comme des faisceaux de fibres, le fait d’orienter la direction du balayage rapide parallèlement à l’axe long des faisceaux de fibres améliore considérablement la résolution temporelle du signal de l’échantillon. En outre, la possibilité de faire pivoter la trame permet d’orienter les éléments de l’échantillon de manière à utiliser le champ d’image le plus efficacement possible. Les arrangements de balayage qui ne permettent pas de faire pivoter la direction de la trame peuvent sérieusement limiter l’utilité du système, à moins qu’on ne puisse faire pivoter l’échantillon lui-même, mais cette opération, beaucoup plus compliquée, n’est généralement pas réalisable.

L’arrangement optique requis pour produire un mouvement linéaire du point d’éclairage dans l’échantillon est déduit en prenant en compte l’optique géométrique du microscope, y compris le fait que l’objectif bénéficie d’une correction télécentrique (un système d’objectif télécentrique positionne les pupilles d’entrée et de sortie à l’infini). Pour réaliser la correction optique complète de l’objectif, les plans de l’image et de l’échantillon doivent rester à des distances fixes de l’objectif et les emplacements des plans d’image conjugués et des plans télécentriques conjugués sont donc connus. Une propriété optique essentielle est que tous les faisceaux de lumière croisent un plan télécentrique à un angle qui est fonction de la position du point source dans le plan de l’échantillon. Étant donné qu’un miroir plat est capable de modifier l’angle de propagation d’un faisceau lumineux, le positionnement d’un miroir sur un plan télécentrique conjugué sur l’axe optique fournit un mécanisme par lequel un changement de l’angle du faisceau se traduira par un déplacement linéaire du point focal dans l’échantillon. Par conséquent, dans le cas le plus simple, le positionnement d’un miroir avec son point de pivot au centre du plan télécentrique conjugué de l’objectif produit un dispositif de balayage à faisceau unidimensionnel capable de modifier la position du point éclairé dans le plan de l’échantillon en fonction de l’angle de pivotement du miroir. Tout plan télécentrique conjugué est une image du plan télécentrique de l’objectif. Lorsqu’un système optique intermédiaire est utilisé, il forme une image du miroir dans l’ouverture d’entrée de l’objectif en maintenant les propriétés télécentriques.

Dans le principe, ce concept de balayage peut être étendu en deux axes perpendiculaires en balayant simultanément le miroir dans deux directions ou en ajoutant un second miroir, bien que des considérations pratiques déterminent généralement le type d’approche adoptée pour un modèle de système global particulier. Lorsque deux miroirs sont utilisés pour un balayage avec le faisceau dans des directions perpendiculaires, ils doivent être placés dans des plans télécentriques conjugués ou bien positionnés à proximité l’un de l’autre (en couplage rapproché). En déviant le faisceau dans des directions orthogonales, un tel système de balayage peut produire les mouvements de balayage rapides et lents nécessaires le long des axes X et Y pour former une image bidimensionnelle complète.

Divers arrangements des composants du système de balayage sont possibles à condition que les exigences principales soient satisfaites. Pour limiter les phénomènes de diffraction du système optique, le plan focal arrière de l’objectif (ouverture d’entrée) doit être constamment inondé uniformément d’une onde plane pendant le balayage. Comme le diamètre physique de cette ouverture varie en fonction des propriétés de l’objectif, tous les autres composants, y compris les sténopés d’éclairage, doivent être adaptés aux objectifs utilisés. Des plans télécentriques conjugués peuvent être produits aux emplacements requis par l’adjonction de composants optiques auxiliaires, et si cette approche est adoptée, les propriétés de ces plans doivent également être soigneusement considérées relativement à leur compatibilité avec les objectifs à utiliser avec le système. Les propriétés des faisceaux des lasers d’éclairage, en particulier le diamètre du profil de faisceau gaussien, sont des facteurs importants pour l’ajustement du diamètre du sténopé et d’autres variables liées à l’éclairage de l’ouverture d’entrée de l’objectif.

Dans la configuration confocale à balayage par faisceau la plus simple, un miroir de balayage est situé dans le plan focal arrière d’une lentille de balayage et est conjugué avec le plan focal arrière de l’objectif. La figure 3(a) représente un arrangement à un seul miroir, qui comprend la lentille de tube requise par un objectif corrigé à l’infini. Le balayage sur un seul axe est facilement réalisé avec cette configuration. Le moyen théoriquement idéal d’arriver à un balayage X-Y consiste à faire pivoter simultanément un miroir unique sur les deux axes (on parle de balayage à cardan). Le plus souvent, deux miroirs de balayage sont utilisés, et deux configurations possibles sont illustrées aux figures 3(b) et 3(c). Si les miroirs sont couplés de façon rapprochée (figure 3(b)), le système peut fonctionner de manière satisfaisante sans nécessiter de composants optiques supplémentaires. Avec une plus grande distance de séparation entre les miroirs de balayage (figure 3(c)), un système de relais télécentrique à plusieurs lentilles doit être utilisé pour optimiser les performances optiques.

Bien que le mécanisme d’exécution d’un balayage ligne par ligne X-Y soit considéré comme l’aspect le plus crucial du système de balayage confocal, une méthode de balayage selon l’axe Z est nécessaire pour acquérir des séries de coupes optiques pour l’imagerie tridimensionnelle, pour acquérir des images bidimensionnelles X-Z ou Y-Z et pour effectuer toute forme de balayage Z en lignes libres. Les configurations typiques du microscope modifient la distance entre l’objectif et l’échantillon en translatant l’objectif ou la platine du microscope. Le déplacement peut être effectué avec précision avec un entraînement piézoélectrique ou un dispositif galvanométrique, mais sur une distance limitée. Plus souvent, cependant, un micromoteur pas-à-pas est utilisé pour entraîner le mécanisme de mise au point fine du microscope, et sur les instruments modernes, les moteurs pas à pas sont capables d’un positionnement du plan focal avec une taille de pas minimale de l’ordre de 10 nanomètres. Pour les applications de fluorescence biologique, un positionnement Z de cette précision est plus que suffisant.

Les développements technologiques introduits dans les microscopes à faisceau unique ont conduit au développement de microscopes à balayage rapide capables de prendre des images à des fréquences vidéo suffisantes pour suivre les processus dynamiques à l’œuvre dans les cellules vivantes. Les scanners à miroir polygonal rotatif peuvent atteindre de très grandes vitesses de balayage, et ils sont utilisés dans de nombreux dispositifs optiques, mais la précision de l’éclairage et de la détection n’est pas suffisante pour une mise en œuvre en microscopie à haute résolution. Diverses configurations combinant des miroirs de balayage avec des déflecteurs acousto-optiques (AOD) ont également été étudiées. Dans certains arrangements, un AOD permet un balayage très rapide sur un axe, tandis qu’un scanner à miroir contrôle l’axe le plus lent. Cette approche est acceptable pour certaines applications, mais elle est problématique pour l’imagerie de fluorescence confocale, car elle ne permet pas de renvoyer l’émission de fluorescence à plus longue longueur d’onde dans le modulateur acousto-optique, qui est spécifique à la longueur d’onde. Le signal partiellement renvoyé, oscillant toujours sur un seul axe, peut être transmis à un photomultiplicateur par une ouverture en fente ou projeté sur un détecteur CCD à réseau linéaire. Bien que les images obtenues ne soient confocales que sur un seul axe, les caractéristiques sont acceptables pour certaines applications. Une approche plus courante pour obtenir des fréquences d’images élevées dans un système à faisceau unique consiste à utiliser des scanners à miroir résonants qui oscillent rapidement. La plupart des grands fabricants ont incorporé des scanners résonants comme option de balayage de série pour faciliter la prise d’images en fréquence vidéo à des vitesses de 30 images par seconde en champ de vision complet. En réduisant le nombre de pas en Y, les scanners résonants peuvent permettre des vitesses de plusieurs centaines d’images par seconde pour les applications nécessitant une résolution temporelle élevée, comme la circulation sanguine dans les capillaires ou la dynamique du calcium.

Les techniques de balayage multifaisceau constituent une bonne alternative aux configurations de balayage monofaisceau, bien que la faible efficacité de l’éclairage ait auparavant limité leur utilisation dans les applications de fluorescence en haute résolution. Dans la variante à balayage en tandem ou à balayage monofaisceau, les scanners à disque rotatif placent des centaines de trous, qui fonctionnent comme des sténopés d’éclairage et de détection, dans le plan d’image intermédiaire du microscope. La configuration type d’un système de balayage à disque de Nipkow est représentée à la figure 2(b). Les trous du disque sont disposés de manière qu’un grand nombre de faisceaux balayent uniformément le champ d’image lorsque le disque tourne, couvrant complètement l’échantillon à une vitesse beaucoup plus grande que ne le feraient les scanners à faisceau unique. Comme les microscopes à balayage par disque forment une image réelle, une caméra CCD ou CMOS peut être placée directement dans le plan de l’image pour capter le signal émis à un rendement quantique bien supérieur à celui des tubes photomultiplicateurs. Malgré cet avantage, qui permet la mise au point et la prise d’images en temps réel des processus dynamiques, plusieurs lacunes ont limité l’utilité pratique des systèmes confocaux à balayage par disque. Par le passé, l’une des lacunes les plus critiques était la dépendance typique envers les sources de lumière conventionnelles à large spectre et la perte extrême de lumière qui se produit au niveau du disque. Toutefois, les progrès réalisés dans la conception des systèmes à disque et l’application des sources laser ont permis de surmonter certains des problèmes d’efficacité. Comme chaque disque comporte des trous de taille fixe, le diamètre du sténopé ne peut pas être adapté à l’objectif particulier utilisé et, par conséquent, le choix d’objectifs qui offriront les performances optimales pour un disque donné est limité. En outre, il n’est pas possible d’optimiser indépendamment le diamètre des sténopés de la source et du détecteur.

Une technique pour améliorer le manque de luminosité qui caractérisait les premiers systèmes à disques de Nipkow consiste à utiliser des microlentilles pour intensifier la source de lumière. Les systèmes les plus anciens ne transmettaient que 1 % environ de l’éclairage incident sur le disque et nécessitaient l’utilisation de caméras CCD ou CMOS refroidies pour compenser le faible niveau du signal. Les systèmes modernes de microscope à balayage par disque intègrent un deuxième disque équipé de milliers de microlentilles, qui tourne en alignement avec le disque de Nickow et amplifie la lumière passant dans les deux sens à travers les ouvertures du disque de Nipkow. Grâce aux progrès réalisés dans le domaine des microlentilles, des lasers et des caméras, les microscopes à balayage par disque sont devenus un outil indispensable pour les applications d’imagerie cellulaire en temps réel.

Conclusions

Diverses modifications supplémentaires du scanner ont été proposées ou mises en œuvre dans le but d’améliorer certains aspects du fonctionnement pratique des microscopes confocaux. Chaque aspect de la microscopie confocale de fluorescence est fondamentalement lié à l’efficacité de la collecte de données en série et à ses limites inhérentes. L’efficacité avec laquelle le signal utile peut être acquis définit l’équilibre à atteindre entre le contraste de l’image et la photodétérioration de l’échantillon et régit également le compromis requis dans la collecte de données en série entre la résolution spatiale du balayage de l’échantillon, le rapport signal sur bruit et la vitesse d’acquisition des images.

Pour l’imagerie de fluorescence en haute résolution, la technologie de balayage la plus sophistiquée et la plus polyvalente actuellement disponible repose sur des variantes utilisant des scanners galvanométriques, et la plupart des grands fabricants de microscopes produisent au moins un microscope confocal qui emploie cette méthodologie. En raison de l’importance que revêt l’efficacité photonique, la simplicité relative des techniques de balayage à faisceau unique leur confère des avantages très nets par rapport aux scanners à disque dans la plupart des applications de fluorescence. Elles sont compatibles avec une grande variété de systèmes optiques et d’équipements vidéo de microscopes conventionnels, elles sont bien adaptées aux principes généraux de microscopie, et la flexibilité de l’ajustement des sténopés permet une optimisation vis-à-vis de variables optiques et d’échantillons spécifiques.