共焦显微镜扫描系统

共焦成像依赖于从经过空间过滤的各个标本点顺序收集光线，然后进行电子信号处理，最终以对应图像点形式进行视觉显示。逐点收集信号过程需要利用某种机制来扫描穿过被观察的标本体积的聚焦照明光束。通常采用三种主要的扫描变化来产生共焦显微镜图像。基本上可以通过以下方式实现等效的共焦操作：采用横向平移的标本台与静止的照明光束相连（载物台扫描）、扫描光束与静止的载物台相连（光束扫描），或者在保持载物台和光源静止的同时用穿过旋转的尼普科夫盘（也称为扫描盘，见图1和2）孔径传输的一系列光点扫描标本。每种技术都有其性能特点，使其在特定的共焦应用中具有优势，但在其他应用中的作用受到限制。

载物台扫描和光束扫描配置是单光束方法，而转盘式方法是一种多光束扫描技术。采用尼普科夫盘扫描概念的系统通常利用非相干广谱光源（如弧光放电灯）而不是激光进行照明，整体亮度不足严重限制了它们在荧光应用中的使用。但现代微透镜阵列和先进的盘设计改进，加上激光照明，扩大了转盘共聚焦显微镜的潜在应用领域。尼普科夫盘系统可以设计成串联扫描或单扫描的形式。在前者中，照明和探测光束沿着串联光路穿过位于盘上截然相反侧不同组的完全相同孔径。单扫描系统通过盘上的每个旋转孔径同时进行照明和探测，从而保持两个光路在穿过物镜时呈现的重合性。

另外一种单光束扫描方法在主要用于集成电路检测的专门反射光显微镜中遭遇了应用受限的情况。物镜本身可以利用扫描透镜系统中的固定光源在静止标本上进行扫描。这种配置具有类似于载物台扫描的光学优势，但支持为静止标本装配测量探头，或以其他方式进行操纵。当采用相对重型的传统物镜时，这种配置不适合快速扫描，因此未得到广泛利用。

现代共焦显微镜是一个集成电子系统，最常见的是以宽视场辐射荧光仪器为基础，然后添加多个激光照明源、一个包含电子和光学元件的扫描头、用于图像显示的计算机和显示器以及用于控制信号采集、处理和图像分析的相关软件。在基本共焦光学配置中，物镜在标本平面上同时形成光源和探测器针孔的图像。通过将针孔定位在共轭焦平面上的显微镜光轴上，它们的图像会在标本焦平面内重叠。尽管焦点平面外的荧光团被激发，但由于探测器的针孔孔径会拒绝离焦光，因此探测仅限于焦平面附近发生的发射。单光束激光扫描共焦显微镜在这种点扫描模式下作为一种采样设备发挥作用，不形成光学（真实）图像。为了能够形成图像，必须移动采样点穿过标本，并收集和存储所产生的信号。扫描头控制构建共焦图像所需的光子信号的产生。图1显示了一个典型商用扫描头的部件，通常包括一个或多个激光输入、荧光滤光片组、一个光栅扫描机制、可变针孔孔径以及用于多个荧光波长探测的探测器（通常是光电倍增管，简称PMT）。

为了扩展共焦点采样原理，以实现生成扩展的标本像场，标本中的点焦点以类似于在电视屏幕上（以及在其他视频应用中；见图2(a)）形成图像时所采用的光栅模式进行扫描。这种机制要求将快速水平扫描（线扫描）与较慢的垂直扫描（或帧扫描）结合使用，后者根据从帧的顶部到底部的顺序位置偏移扫描线。在共焦显微镜的发展史中，采用了许多不同的技术来实现点扫描，其中的几种技术经过改进形成了现有的商用版本。在单光束激光扫描仪器中，典型的光栅扫描机制利用两个由振镜扫描器电机驱动的高速震动反射镜，它们在相互垂直的轴上转动。两个反射镜的协调配合（一个沿X轴扫描，另一个在Y轴上扫描）产生直线光栅扫描。与光速相比，反射镜的扫描速度可以忽略不计，因此，发射的荧光可以被物镜收集，并沿原始照明路径返回，或反向扫描到其位于探测器针孔处的共轭焦平面。照射探测器孔径的信号强度的变化对应于扫描激发光束时标本中不同点处发射的变化。

理想共焦扫描系统提供最佳成像性能所需的若干特性在实践中极难实现。几乎所有的扫描系统配置在操作中都存在一些缺点，并且已经引入了各种光学和电子设计修改以试图纠正这些缺点。实现点扫描的几种方法会降低灵敏度或令灵活性或图像质量受到严重影响，并且目前未在商用生产系统中使用。扫描系统设计的其中一个最重要的要求是，在整个扫描周期内，物镜瞳孔（后聚焦孔径）完全被光充满，以防止在扫描极端出现照明衰减。要做到这一点，最好的办法是采用特定扫描设计，使光束在与物镜后孔径共轭的静止点转动，尽量减少光束在孔径处的移动。在扫描过程中，当光束摇晃时，保持静止的枢轴点在技术上具有挑战性，一些系统通过增加光束展开度来过度填充孔径，从而补偿少量的光束移动。这样做的缺点是会浪费光和降低系统的光子效率。

共焦扫描机制的另一个理想特性是以尽可能高的帧率进行扫描，以提供调整各种扫描模式来匹配成像应用的灵活性。这就要求产生光束扫描的运动部件的惯性很小，以及尽量减少光束不扫描标本的系统停工时间（或每个扫描循环之间的间隔）。每个全帧扫描间隔中用于实际扫描标本的比例被称为系统的占空因数。尽量减少光束的非生产性扫描不仅对实现高帧率至关重要，在某些仪器设计中，还可以减少因占空因数规格不高而造成的不必要标本光子损伤。

围绕光轴自由旋转扫描光栅的能力是共焦成像一个非常重要的特性，它是根据标本形状或其他特征优化扫描方向的一种手段。当对光纤束等拉长特征进行成像时，快速扫描方向与特征的长轴平行，这种朝向可显著改善标本信号的时间分辨率。此外，旋转光栅的能力让标本特征能以最高效利用像场的方式进行定向。不允许旋转光栅方向的扫描安排会严重限制系统的实用性，除非标本本身可以轻松旋转，这种操作问题很大，通常不可行。

在标本中产生照明光斑线性运动所需的光学布置是基于对显微镜几何光学元件的考虑得出的，其中包括物镜采用远心校正的事实（远心透镜系统将入射光瞳和出射光瞳定位在无限远处）。为了实现物镜的完全光学校正，图像平面和标本平面必须保持在距物镜固定距离处，共轭图像平面和共轭远心平面的位置也因此成为已知值。一个关键的光学特性是，所有光束都以某个角度与远心平面相交，该角度随标本平面中源点的位置而变化。由于平面镜能够改变光束的传播角度，在光轴上的共轭远心平面上放置反射镜会提供一种机制，在这种机制下，光束角度的变化将产生标本中焦点的线性运动。因此，在最简单的情况下，定位反射镜时使其枢轴点位于物镜共轭远心平面的中心，会产生一个一维光束扫查器，该扫查器能够随反射镜枢轴角度的变化改变照明光斑在标本平面上的位置。任何共轭远心平面都是物镜远心平面的图像。当采用中间光学系统时，它会在物镜的入口孔径中形成反射镜的图像，从而保持远心特性。

从原则上说，这种扫描概念可以通过同时在两个方向上扫描反射镜或增加第二面反射镜扩展到两个垂直轴，但实用型考量通常决定为特定整体系统设计采取的方法类型。当采用两面反射镜在垂直方向上扫描光束时，它们应该放置在共轭远心平面上，或位于彼此紧邻的位置（紧耦合）。通过在正交方向上偏转光束，这样的扫描系统可以沿X和Y轴产生形成完整二维图像所需的快速和慢速扫描运动。

只要满足主要要求，扫描系统部件的各种布置都可行。为了确保光学系统的衍射限性能，在扫描过程中，物镜后焦平面（入口孔径）必须不断地被平面波均匀填充。由于该孔径的物理直径随物镜的特性而变化，所有其他部件（包括照明针孔）都必须与使用中的物镜相匹配。通过添加辅助光学元件，可以在需要的位置产生共轭远心平面，并且如果采取这种方法，还必须仔细考虑这些光学元件的特性与选择用于配合系统使用的物镜的兼容性。照明激光的光束特性，特别是高斯束流剖面的直径，是调整针孔直径和其他与物镜入口控件的照明有关的变量的重要因素。

在最简单的光束扫描共焦配置中，扫描镜位于扫描透镜的后焦平面中，与物镜的后焦平面共轭。图3(a)所示为单反射镜布置，它包括无限远校正物镜所需的镜筒透镜。采用这种配置可以轻松实现在一个轴上的扫描。理论上实现X-Y扫描的理想方式是同时在两个轴上扫描单个反射镜（称为万向扫描）。更常见的是采用两个扫描镜，图3(b)和3(c)中显示了两种此类可行配置。如果反射镜为紧耦合（图3(b)），则系统无需增加介入光学元件也可满足需求。如果扫描镜的间距较大（图3(c)），必须使用多透镜远心中继系统来优化光学性能。

尽管完成X-Y光栅扫描的机制被视为共焦扫描系统最至关重要的方面，但为了采集一系列光学切面进行三维成像、收集X-Z或Y-Z二维图像以及进行任何形式的自由线Z扫描，需要采用某种Z轴扫描方法。典型显微镜配置通过平移物镜或显微镜载物台来改变物镜与标本的距离。可以用压电驱动或振镜扫描器装置精确地执行移动，但距离范围有限。但更常见的做法是，使用微步电机驱动显微镜的细微焦点控制，在现代仪器上，步进电机能够以10纳米级的最小步长进行焦点定位。对于生物荧光应用来说，达到这种精度的Z定位绰绰有余。

单光束仪器领域的技术发展推动了快速扫描仪器的发展，让后者可以提供视频速率的成像，以跟踪活细胞中的动态过程。旋转多面镜扫查器可以实现非常高的扫描速度，并用于许多光学设备，但不提供在高分辨率显微分析中实现所需的照明和探测精度。此外，还探究了将扫描镜与声光偏转器(AOD)组合的各种配置。在一些布置中，AOD在一个轴上提供非常快速的扫描，由反射镜扫查器控制较慢的轴。此方法在一些应用中可接受，但在共焦荧光成像中存在问题，因为其不允许较长波长荧光发射通过波长特有的声光调制器向回反向扫描。部分反向扫描的信号仍在一个轴上振荡，它们可以通过缝隙孔径传递给光电倍增管，或成像到一个线性阵列CCD探测器上。虽然所得图像只在一个轴上共焦，但对于某些应用来说，其特性可以接受。在单光束系统中实现高帧率的一种更常见方法是，利用快速振荡的谐振镜扫查器。大多数主要制造商已将谐振扫查器作为标准扫描选件纳入，以方便全视野下每秒30帧速度的视频速率图像。通过削减Y值，谐振扫查器可以实现每秒几百帧的速度，适用于毛细管血流或钙动力学等需要高时间分辨率的应用。

多光束扫描技术提供了一个替代单光束扫描配置的方案，尽管以前低照明效率限制了它们在高分辨率荧光应用中的使用。在串联或单扫描形式中，旋转盘扫查器会在显微镜中间图像平面上放置数百个孔，起到照明和探测针孔的作用。图2(b)显示的是一种典型尼普科夫盘扫描系统的配置。盘中孔的排列方式使得旋转盘时，大量光束会均匀地扫描像场，以比单光束扫查器高得多的速率完全覆盖标本。由于盘扫描显微镜会形成真实图像，CCD或CMOS相机可以直接位于图像平面内，以远高于光电倍增管所呈现的量子效率收集发射的信号。尽管具有这种允许对动态过程进行实时聚焦和成像的优点，但若干缺点限制了盘扫描共焦系统的实用价值。以往，其中最严重的一个缺点是典型的对传统广谱光源的依赖，以及在盘处发生的极端光损耗。不过，盘系统的设计和激光源应用方面的进步已经帮助克服了部分效率问题。由于每个盘都具有固定尺寸的孔，针孔直径无法与所用的特定物镜匹配，因此，对于给定盘，性能最佳物镜的选择会受到限制。此外，无法独立优化源和探测器针孔的直径。

一种改善早期尼普科夫盘系统特征化的亮度缺乏的技术是，利用微透镜来增强源光。旧式系统仅传输入射到盘上的照明的大约百分之一，并且需要使用冷却CCD或CMOS相机来补偿低信号电平。现代盘扫描显微镜设计纳入了含有数千个微透镜的第二盘，其与尼普科夫盘协调旋转，并放大在两个方向上穿过尼普科夫盘孔径的光。随着微透镜、激光和相机领域的进步，盘扫描显微镜已成为活细胞成像应用不可或缺的工具。

结语

为了改善共焦仪器实用性能的某些方面，已经提出或实施了各种额外的扫查器修改。共焦荧光显微镜的每一个方面本质上都与效率以及串行数据收集的固有局限性有关。获取有用信号的效率决定了必须在图像对比度和标本光损伤之间达到的平衡，此外，它还控制串行数据采集中采样扫描的空间分辨率、信噪比和图像采集速率之间需要作出的取舍。

对于高分辨率荧光成像，目前可用的最完善和最通用的扫描技术是某种利用振镜扫查器的形式，并且大多数主要显微镜制造商至少生产一种采用这种方法的共焦仪器。由于光子效率的重要性，单光束扫描技术的相对简单性使其在大多数荧光应用中相比圆盘扫查器拥有明显优势。它们与各种传统显微镜光学系统和视频设备兼容，与一般显微术原理的符合度高，并且针孔调整上的灵活性允许对特定光学和标本变量进行优化。