Konfokalmikroskop-Scanning-Systeme

Bei der konfokalen Bildgebung wird zunächst Licht aus räumlich gefilterten einzelnen Probenpunkten sequenziell gesammelt, anschließend werden die Signale elektronisch verarbeitet und als entsprechende Bildpunkte visuell dargestellt. Die punktweise Signalerfassung erfordert einen Mechanismus zur Erfassung des fokussierten Beleuchtungsstrahls hinter dem zu beobachtenden Probenvolumen. Zur Erstellung konfokalmikroskopischer Bilder werden im Allgemeinen drei Abtastverfahren verwendet. Eine im Wesentlichen konfokale Bildgebung kann durch einen seitlich verschiebbaren Objekttisch mit einem stationären Beleuchtungslichtstrahl erreicht werden (Stage-Scanning), durch einen Lichtstrahl, mit dem ein stationärer Objekttisch abgetastet wird (Beam-Scanning), oder durch Abtastung der Probe mit einer Reihe von Lichtpunkten, die durch Öffnungen in einer sich drehenden Abtastscheibe, der sogenannten Nipkow-Scheibe, auf die Probe fallen, wobei sich Objekttisch und Lichtquelle nicht bewegen (siehe Abbildung 1 und 2). Jedes Verfahren hat bestimmte Eigenschaften, die für bestimmte konfokale Anwendungen besser geeignet sind als für andere.

Stage-Scanning und Beam-Scanning sind Single-Beam-Verfahren, die Verwendung einer rotierenden Lochscheibe basiert hingegen auf einem Multi-Beam-Scanning-System. Systeme mit Nipkow-Scheiben verwenden für die Beleuchtung in der Regel nicht-kohärente Breitband-Lichtquellen (z. B. Lichtbogenlampen) statt Laserlicht. Außerdem sind diese Systeme aufgrund der schwachen Helligkeit in den meisten Fällen nicht für Fluoreszenzanwendungen geeignet. Jedoch haben moderne Mikrolinsenanordnungen, umfangreiche Verbesserungen der Scheibenkonstruktion und die Verwendung von Laserlicht die Anwendungsmöglichkeiten für konfokale Spinning-Disk-Mikroskope erweitert. Nipkow-Scheibensysteme können entweder als Tandem-Scanning- oder Mono-Scanning-Systeme ausgeführt sein. Bei der ersten Variante werden der Beleuchtungs- und der Detektionsstrahl in Tandembahnen durch separate Gruppen identischer Öffnungen geführt, die sich auf den diametral gegenüberliegenden Seiten der Scheibe befinden. Das Mono-Scanning-System beleuchtet und detektiert gleichzeitig durch jede rotierende Öffnung auf der Scheibe, wobei die Koinzidenz der beiden Lichtwege beim Durchgang durch das Objektiv erhalten bleibt.

Eine weitere Single-Beam-Scanning-Methode wurde in begrenztem Umfang in speziellen Auflichtmikroskopen vor allem zur Prüfung integrierter Schaltkreise angewandt. Das Objektiv selbst kann über eine stationäre Probe geführt werden, wobei in einem System mit Abtastlinse eine stationäre Lichtquelle verwendet wird. Diese Konfiguration hat ähnliche optische Vorteile wie das Stage-Scanning, allerdings kann hier die stationäre Probe mit Messsonden versehen oder anderweitig manipuliert werden. Die Konfiguration eignet sich nicht für ein schnelles Abtasten, wenn ein relativ massives konventionelles Objektiv verwendet wird, und wird daher nur selten eingesetzt.

Das moderne Konfokalmikroskop ist ein integriertes elektronisches System, das in der Regel auf einem Weitfeld-Epifluoreszenzgerät basiert und zusätzlich mehrere Laserlichtquellen, einen Scankopf mit elektronischen und optischen Komponenten, einen Computer und einen Monitor für die Bildanzeige sowie die zugehörige Software zur Steuerung der Signalerfassung, -verarbeitung und -analyse umfasst. In der grundlegenden konfokalen optischen Konfiguration erzeugt das Objektiv ein Bild der Lichtquellen- und Detektor-Lochblenden auf der Probenebene. Durch die Positionierung der Lochblenden auf der optischen Achse des Mikroskops in konjugierten Fokusebenen überlappen sich ihre Bilder in der Fokusebene der Probe. Fluorophore werden auch außerhalb der Fokusebene angeregt, doch ist die Detektion durch die Lochblende des Detektors auf die Emission in der Nähe der Fokusebene beschränkt, die das Licht außerhalb des Fokus zurückhält. In diesem Punkt-Scanning-Modus funktioniert das konfokale Single-Beam-Laser-Scanning-Mikroskop als Abtastgerät und erzeugt kein optisches (echtes) Bild. Um ein Bild zu erzeugen, muss der Abtastpunkt durch die Probe bewegt und das resultierende Signal erfasst und gespeichert werden. Der Scankopf steuert die Erzeugung des für die Erstellung des konfokalen Bildes erforderlichen Photonensignals. Die Komponenten eines typischen handelsüblichen Scankopfes sind in Abbildung 1 dargestellt und umfassen in der Regel einen oder mehrere Lasereingänge, Fluoreszenzfiltersätze, einen Rasterscanmechanismus, variable Lochblenden und Detektoren (in der Regel Photomultiplier-Röhren oder PMTs) für die Detektion mehrerer Fluoreszenzwellenlängen.

Um nach dem Prinzip der konfokalen Punktabtastung ein erweitertes Bildfeld der Probe zu erzeugen, wird der Punktfokus in der Probe in einem Rastermuster abgetastet, ähnlich wie bei der Erzeugung des Bildes auf einem Fernsehbildschirm (und in anderen Videoanwendungen; siehe Abbildung 2(a)). Dieses Verfahren erfordert eine schnelle horizontale Abtastung (die Zeilenabtastung) sowie eine langsamere vertikale Abtastung (Bildabtastung), bei der die Abtastzeile zeilenweise vom oberen zum unteren Rand des Bildes verschoben wird. In der bisherigen Entwicklung konfokaler Mikroskope wurden verschiedene Techniken zur Punktabtastung eingesetzt, von denen einige zu aktuellen kommerziellen Versionen weiterentwickelt wurden. Bei Single-Beam-Laserscannern werden typischerweise zwei Hochgeschwindigkeits-Schwingspiegel verwendet, die von Galvanometermotoren angesteuert werden und sich um zueinander lotrechte Achsen drehen. Der geradlinige Rasterscan entsteht durch Koordinierung der beiden Spiegel, von denen einer entlang der x-Achse und der andere auf der y-Achse scannt. Die Abtastgeschwindigkeit der Spiegel ist im Vergleich zur Lichtgeschwindigkeit vernachlässigbar, so dass die emittierte Fluoreszenz vom Objektiv aufgefangen und entlang des ursprünglichen Lichtwegs zu ihrer konjugierten Fokusebene am Detektor-Punktloch zurückgeführt (descanned) werden kann. Die Schwankungen der Signalintensität bei der Ausleuchtung der Detektoröffnung entsprechen den Emissionsschwankungen an verschiedenen Punkten der Probe, wenn diese mit dem Anregungsstrahl abgetastet wird.

Mehrere Eigenschaften eines idealen konfokalen Scanning-Systems, die für eine optimale Bildgebungsleistung erforderlich sind, lassen sich in der Praxis nur sehr schwer erreichen. Nahezu alle Scanning-Systeme weisen in der Praxis einige Nachteile auf, wobei mit verschiedenen optischen und elektronischen Modifikationen versucht wurde, diese Nachteile auszugleichen. Einige Methoden zur Punktabtastung verringern die Empfindlichkeit oder erfordern Kompromisse bei der Flexibilität oder Bildqualität und werden in kommerziell hergestellten Systemen derzeit nicht verwendet. Beim Design des Scanning-Systems ist es vor allem wichtig, dass die Objektivpupille (hintere Blendenöffnung) während des gesamten Abtastzyklus vollständig mit Licht ausgefüllt ist, um einen Beleuchtungsabfall an den Abtasträndern zu verhindern. Dies wird am besten dadurch erreicht, dass die Bewegung des Strahls an der Öffnung mit einem Scan-Design minimiert wird, bei dem der Strahl an einem stationären Punkt gedreht wird, der mit der hinteren Blendenöffnung konjugiert ist. Einen stationären Drehpunkt aufrechtzuerhalten, wenn der Strahl während des Scannens hin- und herbewegt wird, ist technisch schwierig zu bewerkstelligen. Einige Systeme kompensieren eine geringfügige Strahlbewegung durch eine Strahlaufweitung, sodass der Lichtstrahl die Apertur mehr als ausfüllt. Dies hat den Nachteil, dass Licht verschwendet wird und die Photoneneffizienz des Systems sinkt.

Eine weitere wünschenswerte Eigenschaft des konfokalen Scan-Mechanismus ist das Scannen mit der höchstmöglichen Framerate, um verschiedene Scan-Modi flexibel an die jeweilige Bildgebungsanwendung anzupassen. Dies erfordert eine minimale Trägheit der beweglichen Komponenten für die Strahlabtastung sowie eine Minimierung der Totzeit des Systems (des Zeitraums zwischen den einzelnen Abtastzyklen). Der Anteil des jeweiligen Vollbild-Abtastintervalls, der tatsächlich zur Abtastung der Probe verwendet wird, wird als Tastverhältnis des Systems bezeichnet. Die Minimierung der unproduktiven Abtastung des Strahls ist nicht nur für eine hohe Framerate von wesentlicher Bedeutung, sondern verringert bei einigen Gerätekonstruktionen auch die unnötige Schädigung der Probe durch Photonen aufgrund einer ungünstigen Tastverhältnis-Spezifikation.

Die Möglichkeit, das Scan-Raster frei um die optische Achse zu drehen, ist für die konfokale Bildgebung sehr wichtig, um die Probenform oder andere Eigenschaften für die Abtastrichtung zu optimieren. Bei der Bildgebung von länglichen Merkmalen wie Faserbündeln verbessert die Ausrichtung der schnellen Scanrichtung parallel zur Längsachse des Merkmals die zeitliche Auflösung des Probensignals erheblich. Durch die Möglichkeit, das Raster zu drehen, können die Probenmerkmale so ausgerichtet werden, dass das Bildfeld möglichst effizient genutzt wird. Scananordnungen ohne Drehung der Rasterrichtung können die Praxistauglichkeit des Systems erheblich beeinträchtigen, wenn die Probe selbst nicht leicht gedreht werden kann, was sehr viel aufwändiger und in der Regel nicht umsetzbar ist.

Die optische Anordnung zur Erzeugung einer linearen Bewegung des Beleuchtungspunkts in der Probe ergibt sich aus der geometrischen Optik des Mikroskops, u. a. dadurch, dass das Objektiv telezentrisch korrigiert ist (bei einem telezentrischen Linsensystem befinden sich Eingangs- und Ausgangspupille im Unendlichen). Um die volle optische Korrektur des Objektivs zu erreichen, müssen Bild- und Probenebene in einem festen Abstand zum Objektiv bleiben, so dass die Lage der konjugierten Bildebenen und der konjugierten telezentrischen Ebenen bekannt ist. Eine fundamentale optische Eigenschaft einer telezentrischen Ebene ist, dass alle Strahlen diese Ebene mit einem Winkel passieren, der von der Position des Bildpunktes in der Probenebene abhängt. Da ein flacher Spiegel die Ausbreitungsrichtung eines Strahls verändert, erlaubt die Positionierung eines Spiegels in einer konjugierten telezentrischen Ebene auf der optischen Achse eine einfache Veränderung des Strahlwinkels durch lineare Verschiebung des Fokuspunkts in der Probe. Im einfachsten Fall bildet also ein Spiegel mit einer Drehachse in der Mitte einer konjugierten telezentrischen Ebene des Objektivs einen eindimensionalen Strahlscanner, der die Position des Beleuchtungspunktes in der Probenebene je nach dem Drehwinkel des Spiegels verändert. Jede konjugierte telezentrische Ebene ist ein Bild der telezentrischen Ebene des Objektivs. Wenn ein optisches Zwischensystem verwendet wird, erzeugt es ein Bild des Spiegels in der Eingangsapertur des Objektivs, wobei die telezentrischen Eigenschaften erhalten bleiben.

Im Prinzip kann dieses Abtastkonzept auf zwei lotrechte Achsen erweitert werden, indem der Spiegel gleichzeitig in zwei Richtungen abgetastet oder ein zweiter Spiegel hinzugefügt wird, allerdings hängt der verwendete Designansatz in der Regel von praktischen Überlegungen ab. Wenn zwei Spiegel zum Scannen des Strahls in zueinander lotrecht stehenden Richtungen verwendet werden, sollten beide in konjugierten telezentrischen Ebenen positioniert werden. Alternativ können sie sehr nahe zueinander um eine konjugierte telezentrische Ebene herum angeordnet werden (Close-Coupled-Konfiguration). Durch Ablenkung des Strahls in orthogonale Richtungen kann ein solches Scansystem die schnellen und langsamen Abtastbewegungen entlang der x- und y-Achse durchführen, um ein vollständig zweidimensionales Bild zu erzeugen.

Es sind verschiedene Anordnungen der Komponenten des Scanning-Systems möglich, sofern die Hauptanforderungen erfüllt sind. Um die beugungsbegrenzten Eigenschaften des optischen Systems zu gewährleisten, muss die hintere Fokusebene des Objektivs (Eingangsapertur) während des Scannens stets gleichmäßig von einer ebenen Welle ausgefüllt sein. Da der physikalische Durchmesser dieser Apertur von den Eigenschaften des Objektivs abhängt, müssen alle anderen Komponenten, einschließlich der Lochblenden zur Ausleuchtung, an die verwendeten Objektive angepasst werden. Durch Zusatzoptiken können an den gewünschten Stellen konjugierte telezentrische Ebenen erzeugt werden. Wenn dieser Ansatz gewählt wird, müssen die Eigenschaften dieser Optiken ebenfalls sorgfältig auf Kompatibilität mit den für das System ausgewählten Objektiven geprüft werden. Die Strahleigenschaften von Beleuchtungslasern, insbesondere der Durchmesser des Gaußschen Strahlprofils, sind wichtige Faktoren für die Einstellung des Lochblendendurchmessers und anderer Variablen im Zusammenhang mit der Beleuchtung der Objektiveingangsöffnung.

In der einfachsten konfokalen Konfiguration mit Strahlabtastung befindet sich ein Scan-Spiegel in der hinteren Fokusebene einer Scan-Linse, die mit der hinteren Fokusebene des Objektivs konjugiert ist. Abbildung 3(a) zeigt eine Anordnung mit einem Spiegel und der für ein unendlich korrigiertes Objektiv erforderlichen Tubuslinse. Das Abtasten auf einer Achse ist mit dieser Konfiguration einfach zu bewerkstelligen. Das theoretisch ideale Verfahren zur x-y-Abtastung ist die gleichzeitige Abtastung mit einem einzigen Spiegel in beiden Achsen (kardanisches Abtasten). Üblicher ist die Verwendung von zwei Scan-Spiegeln. Zwei mögliche Konfigurationen sind in den Abbildungen 3(b) und 3(c) dargestellt. Wenn die Spiegel nahe zueinander angeordnet sind (Abbildung 3(b)), kann das System zufriedenstellend funktionieren, ohne dass eine zusätzliche Optik zwischengeschaltet werden muss. Bei größerem Abstand zwischen den Scan-Spiegeln (Abbildung 3(c)) muss ein telezentrisches Relaissystem mit mehreren Linsen verwendet werden, um die optischen Eigenschaften zu optimieren.

Obwohl der Mechanismus zur Durchführung des x-y-Rasterscans als wichtigster Aspekt des konfokalen Scansystems gilt, ist eine Methode zum Scannen der z-Achse erforderlich, um Serien optischer Schnitte für die dreidimensionale Bildgebung zu erfassen, zweidimensionale x-z- odery-z-Bilder zu erstellen und ein Free-line z-Scanning durchzuführen. Bei typischen Mikroskopkonfigurationen wird der Abstand zwischen Objektiv und Probe durch Verschieben des Objektivs oder des Mikroskoptisches verändert. Die Bewegung kann mit einem piezoelektrischen Antrieb oder einem Galvanometer präzise ausgeführt werden, wenn auch nur in einem begrenzten Bereich. In der Regel wird jedoch ein Mikroschrittmotor für die Feinfokussierung des Mikroskops verwendet, und bei modernen Geräten sind die Schrittmotoren in der Lage, den Fokus mit einer minimalen Schrittgröße in der Größenordnung von 10 Nanometern zu positionieren. Für biologische Fluoreszenzanwendungen ist die z-Positionierung mit dieser Präzision mehr als ausreichend.

Technologische Entwicklungen bei Single-Beam-Systemen haben zur Entwicklung von Schnellabtastinstrumenten geführt, die eine Bildgebung mit Videogeschwindigkeit ermöglichen, um dynamische Prozesse in lebenden Zellen zu verfolgen. Scanner mit rotierenden Polygonspiegeln können sehr hohe Scangeschwindigkeiten erreichen und werden in vielen optischen Geräten eingesetzt, besitzen aber nicht die Beleuchtungs- und Erkennungspräzision, die für den Einsatz in der hochauflösenden Mikroskopie erforderlich ist. Es wurden auch verschiedene Konfigurationen untersucht, bei denen Scan-Spiegel mit akustisch-optischen Deflektoren (AODs) kombiniert werden. In einigen Anordnungen sorgt ein AOD für eine sehr schnelle Abtastung auf einer Achse, während ein Spiegelscanner die langsamere Achse steuert. Dieser Ansatz ist für einige Anwendungen akzeptabel, aber bei der konfokalen Fluoreszenzbildgebung problematisch, da die längerwellige Fluoreszenzemission nicht durch den (wellenlängenspezifischen) akustisch-optischen Modulator zurückgeführt werden kann. Das teilweise rückgeführte Signal, das immer noch in einer Achse schwingt, kann durch eine Spaltblende an einen Photomultiplier weitergeleitet oder auf einen Linear-Array-CCD-Detektor abgebildet werden. Zwar sind die resultierenden Bilder nur auf einer Achse konfokal, aber die Eigenschaften sind für einige Anwendungen dennoch akzeptabel. Ein gängigerer Ansatz zur Erzielung hoher Framerates in einem Single-Beam-System ist die Verwendung von schnell oszillierenden Resonanzspiegelscannern. Die meisten großen Hersteller haben Resonanzscanner als Standard-Scanoption integriert, um Bilder mit Videoraten von 30 Frames pro Sekunde bei vollem Sichtfeld zu ermöglichen. Durch die Verkleinerung der Y-Achse ermöglichen Resonanzscanner Geschwindigkeiten von mehreren hundert Frames pro Sekunde für Anwendungen, die eine hohe zeitliche Auflösung erfordern, z. B. bei der Darstellung des kapillaren Blutflusses oder der Calciumdynamik.

Multi-Beam-Scanning-Techniken sind eine Alternative zu den Single-Beam-Scanning-Konfigurationen, obwohl die geringe Beleuchtungseffizienz ihre Verwendung bei hochauflösenden Fluoreszenzanwendungen bisher einschränkte. Bei der Tandem- oder Mono-Scanning-Variante platzieren Rotationsscheibenscanner Hunderte von Öffnungen, die als Beleuchtungs- und Detektionslöchern dienen, in der Zwischenbildebene des Mikroskops. Die Konfiguration eines typischen Nipkow-Scheibenscannersystems ist in Abbildung 2(b) dargestellt. Die Löcher in der Scheibe sind so angeordnet, dass eine große Anzahl von Strahlen das Bildfeld gleichmäßig abtastet, wenn sich die Scheibe dreht, und die Probe mit einer viel höheren Rate als bei Single-Beam-Scannern vollständig gescannt wird. Da Disk-Scanning-Mikroskope ein echtes Bild erzeugen, kann eine CCD- oder CMOS-Kamera direkt in der Bildebene angebracht werden, die das emittierte Signal mit einer viel höheren Quanteneffizienz erfasst als Photomultiplier-Röhren. Trotz dieses Vorteils, der eine Fokussierung und Abbildung dynamischer Prozesse in Echtzeit ermöglicht, schränken mehrere Mängel den praktischen Nutzen von konfokalen Disk-Scanning-Systemen ein. Zu den gravierendsten Mängeln gehörten bislang die typische Abhängigkeit von herkömmlichen Breitband-Lichtquellen und der extreme Lichtverlust durch die Scheibe. Durch Fortschritte bei der Konstruktion von Scheibensystemen und den Einsatz von Laserlichtquellen konnten jedoch einige der Effizienzprobleme gelöst werden. Da jede Scheibe Löcher fester Größe hat, kann der Lochblendendurchmesser nicht an das verwendete Objektiv angepasst werden. Dadurch bedingt ist die Auswahl an Objektiven, die mit einer bestimmten Scheibe optimal funktionieren, begrenzt. Außerdem ist es nicht möglich, den Durchmesser von der Lichtquellen- und Detektor-Lochblenden unabhängig voneinander zu optimieren.

Eine Technik zur Verbesserung der geringen Helligkeit, die für die frühen Nipkow-Scheibensysteme charakteristisch war, ist der Einsatz von Mikrolinsen zur Verstärkung des Lichts der Lichtquelle. Ältere Systeme übertrugen nur etwa ein Prozent der auf die Scheibe auftreffenden Lichtmenge und erforderten wegen des geringen Signalpegels den Einsatz von gekühlten CCD- oder CMOS-Kameras. Moderne Disk-Spinning-Mikroskope enthalten eine zweite Scheibe mit Tausenden von Mikrolinsen, die sich mit der Nipkow-Scheibe dreht und das Licht verstärkt, das in beide Richtungen durch die Öffnungen der Nipkow-Scheibe fällt. Durch die Fortschritte in der Mikrolinsen-, Laser- und Kameratechnologie sind Disk-Scanning-Mikroskope zu einem unverzichtbaren Werkzeug für die Bildgebung von lebenden Zellen geworden.

Schlussfolgerungen

In dem Bemühen, die praktischen Eigenschaften konfokaler Geräte zu verbessern, wurden verschiedene zusätzliche Scanner-Modifikationen vorgeschlagen oder umgesetzt. Jeder Aspekt der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie hängt grundlegend mit der Effizienz und den inhärenten Grenzen der seriellen Datenerfassung zusammen. Die Effizienz der Erfassung verwertbarer Signale bestimmt das Gleichgewicht, das zwischen Bildkontrast und Fotoschäden an der Probe zu erreichen ist, sowie bei der seriellen Datenerfassung den erforderlichen Kompromiss zwischen der räumlichen Auflösung der Abtastung, dem Signal-Rausch-Verhältnis und der Geschwindigkeit der Bilderfassung.

Für die hochauflösende Fluoreszenzbildgebung ist die raffinierteste und vielseitigste derzeit verfügbare Scantechnologie eine Variante mit Galvanometerscannern. Die meisten großen Mikroskophersteller stellen mindestens ein konfokales Gerät her, das auf dieser Methodik beruht. Wegen der Bedeutung der Photoneneffizienz hat die relative Einfachheit von Single-Beam-Scanning-Techniken bei den meisten Fluoreszenzanwendungen eindeutige Vorteile gegenüber Disk-Scanning-Mikroskopen. Sie sind mit einer Vielzahl herkömmlicher optischer Mikroskopsysteme und Videogeräte kompatibel. Darüber hinaus entsprechen sie den allgemeinen Grundsätzen der Mikroskopie und ermöglichen durch die flexible Einstellung der Lochblende eine Optimierung für bestimmte optische und probenspezifische Variablen.