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Notas de aplicação

Observação 3D de fígado de rato clarificado usando o microscópio FLUOVIEW FV3000


Observação tridimensional do fígado com alta resolução

Normalmente, a observação 3D de amostras de tecido espesso exige um microscópio de excitação por dois fótons devido ao aumento da absorção e dispersão da luz que ocorre com a aquisição de imagens mais profundas na amostra de tecido. Embora o fígado seja, normalmente, um tecido de alta dispersão, o uso de métodos de clarificação, juntamente com uma óptica apropriada, pode permitir a observação 3D do tecido espesso usando o microscópio confocal FV3000. Neste experimento, a objetiva de imersão em óleo de silicone 30x da Olympus, com uma abertura numérica (AN) de 1,05 e uma distância de trabalho (DT) de 0,8 mm, permite a observação 3D em alta resolução da estrutura da árvore biliar em amostras de fígado de rato clarificadas.

Resumo do experimento

Clarificação óptica de amostras de tecido do fígado de ratos

Liver tissue extracted from a mouse

Tecido de fígado coletado de um rato

The tissue is stained for fluorescence by immunostaining

Tecido corado para fluorescência por meio de imunocoloração

The liver tissue is cleared using SeeDB

Tecido de fígado clarificado usando SeeDB

Cortesia de: K. Kamimoto, K. Kaneko, CY. Kok, H. Okada, A. Miyajima e T. Itoh, “Heterogeneity and stochastic growth regulation of biliary epithelial cells dictate dynamic epithelial tissue remodeling,” Elife, 19 de julho de 2016;5, pii: e15034, doi: 10.7554/eLife.15034.

Protocolo do experimento para visualização de uma rede biliar complexa em 3D. Após a coleta do tecido, os tecidos biliares são submetidos a imunocoloração para visualização de uma rede biliar complexa em três dimensões. Em seguida, as amostras com imunocoloração são clarificadas usando SeeDB1)

1) Referência: Ke MT, S. Fujimoto, e T. Imai, “SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction,” Nat Neurosci, agosto de 2013; 16 (8): 1154–61, doi: 10.1038/nn.3447, Epub 23 de junho de 2013, PMID: 23792946

Observação tridimensional de estruturas da árvore biliar em fígado de rato apresentando lesões com uma objetiva de 20x (UPLSAPO20X [AN: 0,75, DT: 0,6 mm])

Three-Dimensional Observation of Biliary Tree Structure in Liver Injury Mice with 20x Objective UPLSAPO20X (NA0.75, WD0.6 mm)

O objetivo do experimento foi medir quantitativamente o comprimento e a espessura dos ramos das estruturas da árvore biliar em fígados de rato com lesões. A objetiva seca de 20x foi usada para a triagem inicial de amostras no FV3000 para obter imagens tomográficas consecutivas e de campo de visão amplo do tecido biliar (verde, marcador de células epiteliais biliares CK19) em amostras de tecido de fígado clarificadas com espessura de 200 µm. Esta configuração permitiu a observação quantitativa eficaz de várias amostras, possibilitando também a detecção rápida da amostra para examinar em uma resolução superior. Na imagem acima, a barra de escala representa 100 µm.

Observação tridimensional das estruturas da árvore biliar em fígado de rato com uma objetiva de 30x (UPLSAO30XS [AN: 1,05, DT: 0,8 mm])

Klf5-LKO mice

Rato de controle

Klf5-LKO mice

Rato Klf5-LKO

Filme: estrutura da árvore biliar do rato de controle

Para obter imagens tridimensionais em uma resolução superior, o microscópio FV3000 e a objetiva de imersão em óleo de silicone de 30x da Olympus foram usados para obter imagens tomográficas consecutivas (intervalo axial Z de 1 µm) do tecido biliar (verde, marcador de células epiteliais biliares CK19) em tecido de fígado com espessura de 200 µm clarificado usando SeeDB. Essa combinação permitiu a observação em alta resolução das árvores biliares do rato de controle e do rato Klf5-LKO, mantendo um campo de visão amplo. No rato Klf5-LKO, os pesquisadores observaram aglomerados celulares CK19+ (seta branca) espacialmente separados da árvore biliar.

Comentário do Dr. Okada: 
Visualização tridimensional e análise estrutural precisa de estruturas biliares complexas

Dr. Hajime Okada National Institute of Genetics Mammalian Development Laboratory

Dr. Hajime Okada

Neste experimento, analisamos estruturas 3D de árvores biliares relacionadas com a remodelação do fígado após uma dieta indutora de lesões no fígado. A estrutura biliar em tecidos de fígado clarificados em ratos Klf5-LKO e em ratos de controle foi comparada usando um microscópio FV3000. O detector altamente sensível do microscópio permitiu a aquisição de imagens de campo de visão amplo de alta de resolução e brilho, bem como observações rápidas com menos imagens e cálculos da média, resultando em um número elevado de imagens que pode ser usado para análise quantitativa. Além disso, a objetiva de imersão em óleo de silicone da Olympus possibilitou a aquisição de imagens em profundidade com alta resolução, permitindo-nos encontrar aglomerados celulares CK19+ espacialmente separados da árvore biliar. Esses resultados sugerem que a estrutura biliar na remodelação do tecido subordinada a várias condições de lesões no fígado pode ser regulada por alguns mecanismos moleculares.

Comentário do Dr. Itoh: 
Aquisição de imagens tridimensionais de fígados clarificados2)

Professor Tohru Itoh The University of Tokyo Quantitative Life Science Social Cooperation Research Department

Dr. Tohru Itoh
Professor associado do projeto

Até agora, a pesquisa médica e bioquímica acerca do fígado baseou-se, maioritariamente, em métodos de observação 2D convencionais usando seções de tecido, em vez de órgãos inteiros e intactos. Contudo, usando esses métodos, é desafiador detectar e compreender as “verdadeiras cores” do fígado sujeito a condições fisiológicas e a várias condições de doenças hepáticas.

O nosso grupo de pesquisa desenvolveu uma nova tecnologia de visualização para coloração e clarificação de tecidos do fígado, com a qual a observação 3D da estrutura biliar em fígados de rato intactos foi realizada com êxito pela primeira vez. Essa combinação da tecnologia de clarificação e de coloração permitiu-nos detectar alterações estruturais na dinâmica biliar (remodelação biliar) e realizar uma pesquisa sobre seus mecanismos regulatórios e funções fisiológicas. Nos experimentos apresentados acima, estabelecemos com êxito um sistema experimental para a visualização eficaz de uma estrutura biliar 3D usando o reagente de clarificação SeeDB e um microscópio confocal. Usando um microscópio FV3000, foram clarificados alguns mecanismos moleculares de remodelação biliar.

Com as técnicas aqui apresentadas, um microscópio confocal é útil para a análise 3D das alterações dinâmicas de vários tecidos e células do fígado, incluindo a estrutura biliar. Esperamos que a nossa nova tecnologia de visualização possa contribuir para o desenvolvimento de diagnósticos e de terapias para doenças hepáticas e medicina regenerativa, por meio de uma melhor compreensão do processo de desenvolvimento e regeneração do ponto de vista da remodelação tecidual e interações intercelulares.

2) Referências:
H. Okada, M. Yamada, K. Kamimoto, CY. Kok, K. Kaneko, M. Ema, A. Miyajima e T. Itoh, “The transcription factor Klf5 is essential for intrahepatic biliary epithelial tissue remodeling after cholestatic liver injury,” J Biol Chem., 27 de abril de 2018; 293(17):6214-6229, doi: 10.1074/jbc. RA118.002372, Epub 09 de março de 2018.

K. Kamimoto, K. Kaneko, CY. Kok, H. Okada, A. Miyajima e T. Itoh, “Heterogeneity and stochastic growth regulation of biliary epithelial cells dictate dynamic epithelial tissue remodeling,” Elife, 19 de julho de 2016; 5, pii: e15034, doi: 10.7554/eLife.15034.

K. Kaneko, K. Kamimoto, A. Miyajima e T. Itoh, “Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis,” Hepatology, junho de 2015;61(6):2056-66, doi: 10.1002/hep.27685, Epub 22 de abril de 2015.

Como o microscópio confocal FV3000 facilitou nosso experimento

O sistema totalmente espectral proporciona alta sensibilidade

A série FV3000 usa a tecnologia de detecção TruSpectral da Olympus que difrata a luz por transmissão, por meio de uma unidade de holograma de fase volumétrica. Essa tecnologia, quando comparada a unidades de detecção espectral convencionais com grades de tipo refletivo, permite um rendimento de luz muito superior e minimiza a potência do laser necessária para a observação de tecidos profundos.

As objetivas de imersão em silicone para aquisição de imagens de células vivas proporcionam uma observação de alta resolução em profundidade

O índice de refração do óleo de silicone (ne≈1,40) é similar ao do tecido vivo (ne≈1,38), permitindo observações profundas de alta resolução dentro do tecido vivo com pouca aberração esférica causada pela disparidade do índice de refração. Além disso, o óleo de silicone não seca nem endurece, por isso não existe a necessidade de reabastecer o óleo, tornando-o ideal para observações com lapso de tempo prolongado.

Agradecimentos
Esta nota de aplicação foi preparada com a ajuda dos seguintes pesquisadores:
Divisão de Desenvolvimento Mamífero, Centro de Pesquisa de Estirpes Genéticas, Instituto Nacional de Genética, Dr. Hajime Ocada
Laboratório de Terapia de Células-Tronco, Instituto de Biociências Quantitativas, Universidade de Tóquio, Professor Associado do Projeto, Dr. Tohru Itoh

Products used for this application

Microscópio de escaneamento a laser confocal

FV3000

  • Disponível para configurações de escâner híbrido galvanômetro/ressonante (FV3000RS) ou apenas galvanômetro (FV3000)
  • Detecção TruSpectral extremamente precisa e eficiente em todos os canais
  • Otimizado para imagem de célula viva com alta sensibilidade e baixa fototoxicidade
Objetivas superapocromáticas

UPLSAPO-S/UPLSAPO-W

  • Compensam as aberrações esféricas e cromáticas e a alta transmissão da região visível para a região infravermelha próxima. 
  • O índice de refração da água ou do óleo de silicone é semelhante ao da célula viva como meio de imersão e é altamente eficaz para imagens de células vivas.

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