Na pesquisa moderna em ciências da vida, a microscopia de fluorescência é uma técnica de formação de imagem popular e poderosa. Com os fluoróforos marcados especificamente em um alvo, o sinal de fluorescência emitido pode fornecer um contraste de formação de imagem excelente com fundo mínimo até o nível molecular.

Os fatores de sucesso da microscopia de fluorescência na pesquisa biológica são provenientes de tecnologias ópticas altamente desenvolvidas, bem como abordagens de marcação extensivas de uma engenharia genética topo de linha.

Ainda assim, apesar do sucesso geral, a necessidade de marcadores ou moléculas fluorescentes ainda limita as aplicações da microscopia de fluorescência:

• Muitas biomoléculas não são fluorescentes, pequenas e facilmente perturbadas por marcadores fluorescentes
• Algumas vezes, o nível de expressão e especificidade de fluoróforos em organismos vivos complica os resultados experimentais
• O uso de marcadores fluorescentes exógenos é preocupante na pesquisa biomédica em humanos

Dadas estas limitações, há uma demanda para métodos de formação de imagem óptica usando um contraste que não seja a fluorescência. Nesta publicação, nós compartilharemos métodos alternativos de formação de imagem biológica para ajudá-lo a pensar além da microscopia de fluorescência e a expandir as suas capacidades de pesquisa.

Pensando além da microscopia de fluorescência

A óptica não linear pode gerar sinais a partir de propriedades intrínsecas de moléculas específicas, criando um contraste na formação de imagem sem precisar de fluorescência.

Graças à disponibilidade de fontes avançadas de laser e técnicas de microscopia, a óptica não linear não é somente para experimentos extravagantes nos laboratórios. Ela se tornou uma solução viável para formação de imagem biológica, inspirando pesquisadores a pensarem além da microscopia de fluorescência. Um bom exemplo é a microscopia óptica de geração harmônica (HG).

Entendendo a microscopia de SHG e THG

Em resumo, HG é um processo óptico não linear no qual n fótons interagem simultaneamente com o material e o convertem em um fóton. A geração de segundo harmônico (SHG, dois fótons em um fóton) e a geração de terceiro harmônico (THG, três fótons em um fóton) são os processos de microscopia de HG mais usados para formação de imagem biológica.

O processo de conversão de fótons em SHG e THG é ilustrado no diagrama de Jablonski (Figura 1) abaixo: SHG fornece o dobro da energia (metade do comprimento de onda) e THG fornece o triplo da energia (um terço do comprimento de onda) dos fótons de excitação.

Figura 1: diagrama de Jablonski dos processos ópticos de SHG e THG. As linhas pontilhadas representam estados virtuais.

Tal como a microscopia multifóton, SHG e THG exigem uma fonte de laser pulsado ultrarrápido, geralmente no intervalo de comprimento de onda de IR próximo, para atender o processo óptico não linear em um volume focal de excitação pequeno. Como resultado, a microscopia de SHG e THG possui os seguintes recursos:

• Capacidade de segmentação óptica intrínseca
• Formação de imagem em profundidade em tecidos altamente dispersivos
• Baixo fotobranqueamento e fototoxicidade
• As intensidades do sinal de SHG e THG são proporcionais ao quadrado e o cubo da potência da excitação do laser, respectivamente

Ainda assim, ao contrário da microscopia multifóton, os sinais de SHG e THG vêm da propriedade óptica e da estrutura do material:

• A microscopia de SHG é geralmente aplicada à formação de imagem de moléculas não centrossimétricas e estruturas organizadas, tal como fibras de colágeno, microtúbulos, miosina muscular, amido, tecidos da pele e estroma da córnea.
• A microscopia de THG é geralmente aplicada à formação de imagem de substâncias ou interfaces com alto índice de refração (em comparação com a água ao redor), como organelas celulares, glóbulos vermelhos ou brancos, gotas lipídicas, tecido adiposo, bainha de mielina dos axônios e ossos.

A microscopia de SHG e THG pode alcançar uma formação de imagem sem marcadores e fornecer informações moleculares e estruturais sobre tecidos biológicos, organismos vivos e até em formação de imagem médica para diagnósticos sem a necessidade de fluoróforos.

Figura 2: imagem de SHG/THG de tecido adiposo não marcado de suíno capturada usando um microscópio multifóton FVMPE-RS da Olympus. O sinal SHG (azul claro) mostra fibras de colágeno e o sinal THG (magenta) mostra a gordura no tecido adiposo.

Agora que nós cobrimos os básicos da microscopia de SHG e THG, a nossa próxima seção fornecerá algumas dicas para ajudá-lo a colocar estas técnicas em prática.

Considerações práticas sobre a configuração da microscopia de SHG e THG

A microscopia de SHG e THG pode compartilhar a mesma fonte de laser pulsado de IR próximo e unidade de verificação laser com a microscopia multifóton, por isso o nosso microscópio multifóton FVMPE-RS combina prontamente a microscopia de SHG e THG para criar um sistema de formação de imagem multimodal.

Encontre a seguir duas considerações práticas ao configurar a microscopia de SHG e THG:

1. Detecção frontal e detectores de alta sensibilidade:

   Embora a emissão de fluorescência seja geralmente isotrópica, os sinais SHG e THG possuem certa direcionalidade originando do processo de mistura de ondas. Na maioria dos casos, o sinal frontal (longe da objetiva) é muito mais forte que o sinal traseiro (em direção à objetiva). Neste caso, um condensador de alta AN e detectores non-descanned (NDDs) são uma boa escolha para a detecção do sinal frontal. Em tecidos altamente dispersos, algum sinal frontal pode se dispersar para a traseira e ser detectado pela detecção do sinal traseiro. Neste caso, use NDDs de alta sensibilidade como um tubo fotomultiplicador de fosfeto de arseneto de gálio (PMT GaAsP) para otimizar a eficiência de detecção traseira, especialmente quando o sinal de detecção frontal não é aplicável em amostras globais ou em animais vivos.

2. Boa intensidade de laser a um comprimento de onda mais longo:

   O sinal THG exige uma boa intensidade de excitação de laser para atender o processo de óptica não linear e é gerado com um terço do comprimento de onda de excitação. Para obter um sinal de transmissão e detecção melhor em microscopia de THG, use uma fonte de laser com boa intensidade em um comprimento de onda mais longo que 1.200 nm para que o sinal THG possa estar dentro do intervalo de luz visível. No passado, era necessário um laser pulsado de IR próximo, um oscilador paramétrico óptico (OPO) e um operador habilmente treinado para gerar uma fonte laser acima de 1.200 nm. Hoje em dia, com os grandes avanços da tecnologia laser, é possível gerar uma intensidade laser imensa com um comprimento de onda longo a partir de um laser pulsado integral ultrarrápido como o Spectra-Physics InSight^® X3.

Expanda as suas capacidades de pesquisa além da microscopia de fluorescência

Equipado com as tecnologias de ponta de microscopia e laser, o nosso sistema de formação de imagem multifóton FVMPE-RS dá a você a oportunidade de ter a microscopia multifóton, SHG e THG em uma única plataforma de formação de imagem multimodal. Com estas poderosas capacidades, você pode expandir as suas capacidades de pesquisa além da microscopia de fluorescência.

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