3D微球模型中细胞内自噬通路的真实3D分析

摘要

3D培养模型已被用于预测药物功效或毒性。在本应用指南中，我们重点介绍细胞内自噬途径。首先，我们已经确认了EGFP-LC3探针对监测模型自噬状态的有用性。之后，使用结合FLUOVIEW™FV3000激光扫描共聚焦显微镜和NoviSight™软件的奥林巴斯真正3D分析工作流程对候选药物氯喹的效果进行定量评估。我们证明这种分析工作流程可以作为候选药物体内研究分析的一种替代方法。

引言

细胞内分子动态变化与人类的多种病理密切相关。自噬是一种降解并回收细胞器和蛋白质的细胞内过程，而自噬失调与人类疾病密切相关。为了更好地了解疾病过程并测试药物功效，在病理和处理条件下监测人类细胞的自噬状态非常关键。
3D培养模型（如微球或类器官）与复杂的体内微环境非常类似。为了评估药物对微球细胞的功效，定量分析细胞内显微图像至关重要。在本应用指南中，我们使用奥林巴斯FV3000激光扫描共聚焦显微镜和NoviSight分析软件的真实3D分析工作流程评估了动态分子内自噬过程并定量评估了候选药物的效果。

优点

• 3D培养模型中分子内事件的定量分析
   

结果与讨论

LC3蛋白在自噬过程中是非常有用的标记物。例如，据报告，EGFP-LC3荧光点在自噬体积累时将会增加。自噬体的形成受调节自噬活性或自噬体周转的各种化合物影响。这些化合物其中的一些目前正在进行临床试验。一种是最初作为抗疟疾药物的氯喹（CQ），由于其可以抑制自噬体和溶酶体的融合，目前正在临床试验用于癌症处理。

使用2D培养系统验证自噬标记物

我们对EGFP-LC3探针在2D培养系统测量CQ对自噬过程抑制作用的有效性进行了验证。我们制备了稳定表达EGFP-LC3的U2OS骨肉瘤细胞系。细胞在微孔板孔内单层培养。加入CQ后，将细胞固定并使用Hoechst 33342染色。荧光图像显示，CQ处理诱发了EGFP-LC3点的形成（图1 A和B）。根据每个细胞核的位置测量每个细胞的点状面积。随着CQ浓度的增加，点状面积也增加，其证实了EGFP-LC3探针可用于自噬过程测量。
 

肿瘤肿瘤微球肿瘤微球模型中LC3点状面积的定量分析

为了监测3D培养模型中的自噬状态，我们选择建立来自宫颈癌的HeLa细胞系。HeLa细胞适用于无支架的3D培养方案，并可形成大小一致的肿瘤微球肿瘤微球。我们制备了稳定表达EGFP-LC3的HeLa细胞系。
将细胞种入圆底、低附着力的微孔板中。培养五天后，将微球使用CQ处理七个小时。然后，将微球固定，进行膜通透性处理，并将细胞核染色，最后使用SCALEVIEW-S4（FUJIFILM WAKO）透明化。
我们使用奥林巴斯FLUOVIEW™FV3000激光扫描共聚焦系统对微球进行观察。我们选用的是硅油浸没物镜（UPLSAPO30XSIR），原因是其具有较高的数值孔径（NA）和较小的球差。图2（A）^*显示为赤道处未经处理微球的单个Z切片图像。EGFP信号均匀出现在细胞中。相反，CQ处理可诱导细胞中点状EGFP信号的形成（图2（B）^*）。在微球的外围区域和中心区域均观察到点状形成。CQ处理并未引起微球尺寸的任何明显变化，表明细胞内自噬过程可能是评估CQ在3D肿瘤微球肿瘤微球中功效的更好标志物。

为了定量分析3D培养模型中的细胞内事件，我们使用奥林巴斯的真正3D分析工作流程，该工作流程将使用FV3000激光扫描共聚焦显微镜捕捉的图像与使用NoviSight™软件进行的分析相结合，与传统的分析方法相比，其具有更多优势。我们在常规分析中，使用的是来自多个Z切片图像识别对象的积分特征值或分析多个Z切片图像的投影图像。由于可能导致对感兴趣对象进行重复计数或忽略被其他对象重叠和遮盖的感兴趣对象，这些方法并不可靠。相反，奥林巴斯的真正3D分析工作流程采用通过FLUOVIEW™软件优化的Z序列图像采集及最佳Z轴步进设置。该软件可以进行3D重构并将感兴趣的对象识别为体像素。然后使用NoviSight软件进行统计分析。从FLUOVIEW到NoviSight软件的工作流程非常简单，其成为分析3D培养模型的理想平台。
 

为了计算微球中自噬阳性细胞的数量，该软件识别了每个细胞的细胞核。接下来，将每个核周围的区域定义为掩盖区域。最后，掩盖区域中的EGFP信号点被识别为点对象（图2（C）^*）。包含超过三个点对象的细胞被认为是自噬阳性细胞。未经药物处理的3D微球包含约1.4％的自噬阳性细胞，而使用CQ处理的微球显示包含66.6％的自噬阳性细胞（图2（D）^*）。定量分析还支持CQ诱导在肿瘤肿瘤微球肿瘤微球中形成点状。
 

结论

奥林巴斯FLUOVIEW FV3000激光扫描共聚焦显微镜和NoviSight软件作为真正3D分析工作流程的一部分，可用于定量评估CQ对3D培养模型中细胞内自噬过程的影响。这项研究表明，研究人员可以利用该工作流程以剂量依赖的方式描述药物功效或客观筛选多种候选药物。另外还有其他与药物功效或药物毒性有关的细胞内分子标记物，如染色体上的FISH信号或荧光标记信号分子的转位。该工作流程可帮助定量评估3D培养模型中的各种细胞内事件，并可作为代替在体研究的候选药物分析替代方法。

参考文献

• Maria C等人，（2019）攻克人类疾病的靶向自噬。International Journal of Molecular Sciences.20(3): E725. doi: 10.3390 / ijms20030725 
• Yan C等人，（2013年）疾病的靶向自噬处理：生物学和药理学。Pharmacological Reviews.65: 1162-1197. doi: 10.1124 / pr.112.007120 
• Daniel JK等人，（2008年）使用和解释高等真核生物自噬测定方法的指南。Autophagy.4(2): 151-175. doi: 10.4161/auto.5338

作者

Kazuhito Goda

*虽然它已经成为医学研究中最重要的细胞系之一，但我们必须认识到Henrietta Lacks对科学的贡献是在未经她同意的情况下发生的。这一不公正现象在导致免疫学、传染病和癌症方面重大发现的同时，也引发了关于医学中的隐私、伦理和同意方面的重要对话。
要了解更多关于Henrietta Lacks的生平和她对现代医学的贡献，请点击这里。
http://henriettalacksfoundation.org/