Hoffman调制反差也叫做“浮雕反差”，是旨在提高塑料容器中未染色和活生物材料对比度的一种光学显微镜技术。它的工作原理是检测光学梯度，并将其转换为光强的变化。
本篇博文详细讨论了Hoffman调制反差——从基本的显微镜配置到其优势和局限性。
图1 Hoffman调制反差的基本显微镜配置
Hoffman调制反差的基本显微镜配置
图1显示了Hoffman调制反差的基本显微镜配置。在物镜的后焦平面上，插入一个光振幅空间滤波器——Hoffman称之为“调制器”。通过这一系统的光强围绕平均值上下变化，然后接受调制。可用于调制反差的物镜包括10、20和40倍的整个放大范围。
调制器分三个区（详见图2）：
- 一个较小的暗区，靠近后焦平面外缘，仅透射1%的光线（图2中的D区）
- 一个狭窄的灰色区域，透射15%的光线（图2中的G区）
- 其余的透明区域，覆盖物镜后部的大部分区域，透射100%的光线（图2中的B区）
Hoffman调制反差显微镜的调制器和狭缝
与相差显微镜中使用的相位板不同，Hoffman调制器不会改变任何区域中透射光线的相位。在调制反差光学元件下观察时，在普通明场显微镜中基本不可见的透明物体，会呈现由相位梯度决定的三维(3D)外观。
在Hoffman的设计中，狭缝处于聚光镜的前焦平面，如图1所示。当光线通过离轴狭缝时，它会在调制器所在物镜的后焦平面（也称为傅里叶平面）上成像。包含离轴狭缝板的聚光镜前焦平面与物镜后焦平面中的调制器光学共轭。图像亮度与样本中光密度的一阶导数成正比，并由相位梯度衍射图案的零阶所控制。
相反的梯度会导致狭缝图像偏向调制器非常暗的部分或明亮部分。例如：使用调制反差光学元件对一个假设含有正负相位（厚度）梯度和平坦（无梯度）区域的样本进行成像。正梯度将光线偏转到调制器的透射区而不会被衰减，并且100%的光线会传输到中间像平面。同样，因负梯度而偏转到调制器暗区的光线被衰减到其先前值的大约1%。
样本的所有无梯度部分与背景，透过调制器的灰色部分，其中约有15%的光线被传输到中间像平面。因此，梯度一侧图像区的亮度为暗。梯度对侧的亮度生成明亮的图像区，而无梯度区域和背景在图像上显示为灰色。
Hoffman调制反差的四大优势
Hoffman调制反差有着很多优势和一定的局限性。Hoffman调制反差的部分优势包括：
1.更充分地利用物镜的数值孔径。
在Hoffman调制反差下使用更高的数值孔径可让您获得更好的细节分辨率，以及良好的样本对比和可见性。
2.可使用塑料容器。
Hoffman调制反差可成功用于塑料培养皿等双折射材料，而不会让图像扭曲。双折射是指某些材料中出现的一种现象，即入射光束（照射表面的光线）在透过材料时分裂为两束。
Hoffman调制反差是替代不兼容双折射材料的对比方法的一种不错的方法。例如，使用微分干涉相差(DIC)检查双折射材料时可能会出现伪影、对比度损失和其他图像质量问题。
因此，Hoffman调制反差是观察并对塑料容器中的细胞、组织与器官培养物进行成像的理想方法。
3.光学切片能力。
这一技术也支持“光学切片”。切片能让您聚焦于样本的单一薄平面，而不会受聚焦平面上下方区域中所产生混淆图像的干扰。
样本的深度在平行于显微镜光学轴的方向上测量。聚焦图像可确定样本到图像的正确距离，从而允许与目镜距离固定的预定平面（像平面）上衍射波的干涉。因此，只要有足够的对比度，就可以独立观察样本中不同深度下的衍射物体。
在各后续平面上陆续聚焦后，即可在样本的整个深度上进行光学切片。这一系统中，景深是从一层到成像不同细节的下一层的距离，并且由物镜的数值孔径决定。物镜的数值孔径越高，景深就越小。物镜的数值孔径越低，景深就越大。样本的光学均匀性越低，物镜分离和聚焦特定光学切片的整体能力也越低。
4.可见性增强。
Hoffman调制反差的另一个优势是可见性的增强。图像呈现为阴影或伪三维，因细节两侧的不同对比度而增强了可见性。图像中也没有光晕——不同于相差光学元件生成的图像。Hoffman调制反差将相位梯度信息转换为振幅差，与相差显微镜生成的相位关系变化（和光程差）完全不同。
调制器中的暗区和灰色区会生成含不同灰度和没有颜色的图像。调制器使用灰色区和暗区代替透射率值相同的彩色区域，即可在调制反差图像中引入颜色。此时，由相位梯度产生的图像将由相同色调中梯度相似的颜色渲染。目前，我们尚未发现任何其他含彩色区的商用调制滤波器。
Hoffman调制反差的局限性
Hoffman调制反差有着多个优势和一定的局限性。首先，查看这些图像时必须小心。这是因为伪三维图像是通过目镜观察的，而不同的观察者可能将图像中的“峰”看成“谷”。这一系统也对垂直于狭缝长度的梯度高度敏感。因此，这一技术要求一定的技巧才能正确定位样本，以获得最佳效果。
