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利用消卷积进行图像处理

消卷积是一种提高光学显微图像对比度和清晰度的基于大量计算的图像处理技术。除非空间两点彼此之间的距离超过波长半峰宽,否则光学显微镜因衍射极限而无法分辨单一结构。低于该衍射极限的每个点源都会被显微镜模糊成所谓的点扩散函数(PSF)。使用传统的宽场荧光显微镜,焦平面上方或下方区域的非焦面光线会导致所采集的图像更加模糊。消卷积通过利用光学系统的点扩散函数以及重建由较小点源集合构成的理想图像的方式消除或逆转这一问题。

光学显微镜的点扩散函数会根据显微镜和样品的光学特性而发生变化,因此很难通过实验确定整个系统准确的点扩散函数。为此已经开发出用于确定点扩散函数的数学算法,并通过消卷积方法进行最佳重建获得理想图像。使用荧光显微镜采集的包括非三维图像在内几乎所有图像均可以进行消卷积。

商业软件把这类算法整合到更具成本效益的用户友好的程序包中使用。每种消卷积算法在确定卷积运算的点扩散和噪声函数方面均有所不同。基本成像公式为:

g(x) = f(x) * h(x) + n(x)

x: 空间坐标
g(x): 所观察图像
f(x): 目标
h(x): 点扩散函数
n(x): 噪声函数
*:卷积

去模糊算法

去模糊算法对三维图像堆栈的每个二维平面进行操作。最近邻算法是最常见的去模糊技术,其通过模糊相邻平面(使用数字模糊滤波器的z + 1和z-1)对每个z平面进行操作,然后从z平面减去模糊平面。多近邻算法将这一概念扩展到用户可选择的多个平面。通过将算法应用于堆栈中的每个平面对三维堆栈进行处理。

由于只是在少量图像平面上执行相对简单的计算,这类去模糊算法在计算上具有经济性(快速)。但是,这些方法存在一些缺点。例如,其点扩散函数在附近的z平面彼此重叠,因此点扩散函数可能有信号来源于不属于它们的平面上,从而更改变对象的外观位置。在对单个二维图像进行去模糊处理时,这一问题尤为严重,因为通常衍射斑或非焦结构发出的光被作为当前焦平面中的信号而锐化。

逆滤波器算法

逆滤波器通过对图像进行傅立叶变换并将其除以点扩散函数的傅立叶变换而发挥作用。傅立叶空间中的除法等效于现实空间中的消卷积,这使得逆滤波成为逆转图像卷积最简单的方法。其计算速度快,速度与二维去模糊方法相仿。但是,这一方法的实用性受到噪声放大的限制。在傅立叶空间中进行分割时,通过除法运算会放大傅立叶变换中的微小噪声变化。其结果是模糊消除与噪声增益相折衷。该技术还可能引入称为ringing的伪影。

通过对产生图像的物体结构进行某些假设,可以减少额外的噪声和ringing。比如,如果假定对象相对平滑,则可消除具有粗糙边缘的噪声。正则化可在逆滤波器中一步执行,也可以迭代应用。其结果为去除高频傅立叶的图像,从而让外观更平滑。图像中去除的大部分“粗糙度”均位于傅立叶频谱上,而该频率远远超出分辨率极限,因此该过程无法消除显微镜所记录的结构。但是,由于存在丢失细节的可能性,因此逆滤波器的软件实现通常提供可调整的参数,让用户能够在控制平滑和噪声放大之间的取舍。在大多数图像处理软件程序中,这些算法存在多种名称,其中包括维纳消卷积、正则化最小二乘、线性最小二乘和Tikhonov-Miller正则化。

受限迭代算法

典型的受限迭代算法通过应用额外算法将光子恢复到正确位置并提高逆滤波器的性能。这些方法基于上一循环结果以连续方式运行,因此称为迭代。首先对对象进行初始估计,并与点扩散函数进行卷积。将所得的“模糊估计”与原始图像进行比较,以此计算出一个代表模糊估计与原始图像的相似程度的误差标准。使用包含在误差标准中的信息进行新的迭代-将新的估计值与点扩散函数卷积在一起,再计算出新的误差标准,依此类推。最佳结果是尽可能减小误差标准的估计。随着算法的循环,每次软件确定误差标准尚未最小化时,新的估计值就会再次模糊,并重新计算误差标准。重复该循环,直到将误差标准最小化或达到所规定的阈值为止。最终还原的图像为最后一次迭代时的对象估计。

受限迭代算法可提供良好的结果,但并不适合所有成像设置。其需要较长的计算时间,并且对计算机处理器要求很高。这些可以通过现代技术来克服,比如基于GPU的处理可以显著提高速度。为了充分利用算法,需要三维图像,尽管二维图像也可以获得有限的性能。

共聚焦、多光子和超分辨率

有人认为可以将消卷积作为共聚焦显微镜的替代技术。1严格上讲并非如此,因为消卷积技术也可应用于共聚焦显微镜图像。实际上,消卷积可以恢复共聚焦、多光子或超分辨率光学显微镜图像。

通过共聚焦或超分辨率显微镜和消卷积技术共同改善光学图像所实现的清晰度提升超出了单独使用这两种技术所达到的效果。但是,对这些专用显微镜图像进行消卷积的主要好处是可以减少最终图像中的噪声。这对于活细胞超分辨率或共聚焦成像等弱光应用特别有用。多光子图像的消卷积也已成功用于消除噪声和提高对比度。在任何情况下,均需注意使用适当的点扩散函数,尤其是在共聚焦针孔孔径可调的情况下。

*1.Shaw, Peter J., 和David J. Rawlins。共焦显微镜的点扩散函数:其测量以及在3-D数据消卷积中的使用。J.ournal of Microscopy。163,第2期(1991):151–165.

共聚焦、多光子和超分辨率共聚焦、多光子和超分辨率

实践中的消卷积

软件实现消卷积算法的方式会极大影响处理速度和质量。可以对算法进行优化,以减少迭代次数并加速收敛,以生成稳定的估计值。例如,未优化的Jansson-Van Cittert算法通常需要50到100次迭代才能收敛到最佳估计值。通过对原始图像进行预滤波以抑制噪声并在前两次迭代中使用附加误差标准进行校正,该算法可收敛到仅5至10次迭代。

当使用实验测得点扩散函数时,使用噪声最小的高质量点扩散函数至关重要。为达到这一目的,商业软件中包含有可通过对点扩散函数的傅里叶变换求平均值的方式减少噪声并增强径向对称性的预处理算法。很多软件包还在点扩散函数中强制执行轴对称,并假定没有球差。这些步骤减少了实验点扩散函数的噪声和像差,并在修复质量上产生显著差异。

预处理还可对原始图像使用诸如背景减除和平场校正之类的算法。这些操作可以改善信噪比并消除某些对最终图像有害的伪影。

通常,数据重构结果还原度越高,消卷积图像所需的计算机内存和处理器时间就越多。以往,为适应处理能力,图像会被细分为多个子集 ,但是现代技术已经消除这一问题,并扩展为更大的数据集。

奥林巴斯消卷积解决方案

奥林巴斯cellSens成像软件具有TruSight消卷积功能,该功能可将常用的消卷积算法与奥林巴斯FV3000和SpinSR10显微镜采集图像的新技术相结合,成为用于图像处理和分析的全套工具组。

Lauren Alvarenga
奥林巴斯美国 生命科学部
Olympus Corporation of the Americas

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