Erkennungsmethoden in der konfokalen Mikroskopie

Die konfokale Mikroskopie ist eine klassische Technik zur Untersuchung der Proteinexpression und von Interaktionen in dicken Gewebeproben. Im Gegensatz zur Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskopie, die emittierte Photonen aus dem gesamten Sichtfeld (auch Photonen außerhalb der Fokalebene) erfasst, verwendet die konfokale Mikroskopie eine mit der Fokalebene konjugierte Lochblende, um Licht außerhalb der Fokusebene zu unterdrücken und nur ein optische Bild der Gewebeebene im Fokus zu erzeugen.

Die konfokale Methode liefert effektiv scharfe, hochauflösende Bilder von dicken Proben, durch den inhärenten Lichtverlust der Lochblende ist es jedoch schwierig, Bilder mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis aufzunehmen. Aus diesem Grund müssen die restlichen optischen Komponenten des Mikroskops hocheffizient sein, um die zur Erzeugung eines Bildes erforderliche Laserbelichtung zu minimieren und so viele emittierte Photonen wie möglich zu erfassen.

Unterschiede zwischen Filter- und Spektrallicht-Detektionstechniken

Bei Verwendung von Filtern wird vor der Photomultiplier-Röhre (PMT) ein Bandpassfilter platziert, der bestimmt, welche Wellenlängen des Lichts zum Detektor gelangen. Bei der spektrumbasierten Detektion wird mit einem Gitter oder Prisma ein Spektrum des emittierten Lichts erzeugt, so dass sich die gewünschten Bänder des Emissionsspektrums feinabstimmen lassen.

Die spektrumbasierte Detektion ermöglicht auch „Lambda-Scans“, bei denen Profile des gesamten Spektrums des emittierten Lichts in bestimmten Bandbreiten und Schrittgrößen erzeugt werden können.

Spektrale Erkennungsverfahren ermöglichen zwar flexiblere Experimente, allerdings traditionell auf Kosten der Empfindlichkeit. Die spektrumbasierte Detektion ist flexibler, die Detektion unter Verwendung von Filtern aber in der Regel effizienter.

Spektroskopie in der Mikroskopie

Um ein Spektrum zu erzeugen, nutzen spektrumbasierte Detektionsverfahren bisher zwei Methoden: Reflektierende Beugungsgitter und Prismensysteme. Die Reflexionstechnologie wurde in handelsüblichen konfokalen Mikroskopen erstmals in den späten 1990er Jahren eingesetzt (Abbildung 1). Kurze Zeit später kam ein konfokales Prismensystem auf den Markt.

Wie bereits erwähnt, sind spektrumbasierte Detektionstechniken tendenziell weniger effizient als Filtertechniken. Drei Faktoren beeinträchtigen die Effizienz:

• Verlust von Beugungen höherer Ordnung: Wenn Licht an einem Beugungsgitter reflektiert wird, entstehen Beugungen verschiedener Ordnung. Da nur die Beugung erster Ordnung zum Detektor gelangt, gehen die Beugungen höherer Ordnung verloren.
• Polarisationsabhängiger Verlust: Die Reflexion des Lichts ist je nach Polarisationszustand unterschiedlich, bei reflektierenden Beugungsgittern ist die Beugungseffizienz von P-polarisiertem Licht geringer als die von S-polarisiertem Licht.
• Wellenlängenabhängiger Wirkungsgrad von reflektierenden Beugungsgittern: Der Beugungswirkungsgrad erreicht bei einer bestimmten Wellenlänge ein Maximum, bei höheren oder niedrigeren Wellenlängen verschlechtert er sich.

Diese drei Faktoren treten bei reflektierenden Beugungsgitter immer auf, daher sind reflektierende Beugungsgitter am wenigsten gut für die spektrale Detektion geeignet. Bei Erkennungsverfahren mit Prismen geht gebeugtes Licht höherer Ordnung nicht verloren, aber die spektrale Auflösung ist bei längeren Wellenlängen schlechter. Aufgrund dieser Nachteile konnte bisher keine der beiden Technologien Filterdetektionssysteme vollständig ersetzen.

Abbildung 1: Zeitleiste der konfokalen Mikroskopie und spektrumbasierter Detektiontechnologien

Volumen-Phasen-Hologramm: Ein anderes Konzept für Beugungsgitter

Fast zwei Jahrzehnte lang wurden reflektierende Beugungsgitter und Prismensysteme unabhängig vom Hersteller für die meisten Spektroskopieanwendungen in konfokalen Mikroskopen eingesetzt. Aber nicht nur die Mikroskopie, sondern auch die Astronomie setzt auf die Spektroskopie als Mittel der Bilderzeugung. Die Spektroskopie in der Astronomie ähnelt der Mikroskopie insofern, als interessierende astronomische Objekte (wie Galaxien und andere Himmelskörper) ebenfalls Licht vom ultravioletten bis zum infraroten Bereich aussenden. Astronomen müssen diese Komponenten des Lichts unterscheiden können, um genaue Bilder solcher Objekte zu erstellen (Abbildung 2).

Abbildung 2: Anwendung der Spektroskopie in der Astronomie zur Konstruktion des Bildes einer Galaxie
Mit freundlicher Genehmigung von: NASA, ESA, Dan Maoz (Tel Aviv University, Israel und Columbia University, USA)

Eine der Schlüsseltechnologien, die die Astronomen dazu nutzen, ist das Volumen-Phasen-Hologramm (VPH). Statt ein Lichtspektrum durch Lichtreflexion an der Oberfläche eines Beugungsgitters zu erzeugen, arbeiten VPH-Gitter mit Durchlicht: Dabei passiert das Licht ein Gitter, welches das einfallende Licht in seine spektralen Komponenten zerlegt (Abbildung 3). Astronomische Experimente mit VPH-Gittern wurden erstmals um das Jahr 2000 veröffentlicht, und die Technologie fand schnell Anklang. Seither werden in einigen der größten Labore der Welt sehr große VPH-Gitter erfolgreich in der Spektroskopie eingesetzt.

Abbildung 3: Querschnittsdiagramme des Beugungsmechanismus an Oberflächenbeugungsgittern und Volumen-Phasen-Hologrammen. Oberflächenbeugungsgitter (links) reflektieren Licht an der Oberfläche des Gitters, VPH-Gitter (rechts) dagegen lassen das Licht durch das Gitter hindurch.

Im Jahr 2016 wurde die VPH-Technologie mit der Einführung des konfokalen Mikroskops FLUOVIEW™ FV3000 mit TruSpectral™ Detektionstechnologie erstmals in einem im Handel erhältlichen Mikroskop implementiert, das ein VPH zur Durchlichtbeugung nutzt. Vorteile der Verwendung von VPH-Gittern in der Mikroskopie:

• Geringe Polarisationsempfindlichkeit
• Geringe Streuung (hohe Effizienz)
• Hohe Transmission im gesamten Spektrum (insbesondere im roten Bereich besser als bei Reflexionsbeugungsgittern)
• Flexibler als Filter

Durch den Einsatz eines Transmissionsbeugungsgitters werden mit der TruSpectral-Technologie viele Probleme umgangen, die typischerweise mit herkömmlichen spektralen Detektionsmethoden verbunden sind. So ist der polarisationsabhängige Verlust minimal im Vergleich zu den signifikanten Verlusten, die typischerweise bei reflektierenden Beugungsgittern auftreten. Außerdem beseitigt das VPH die Wellenlängenabhängigkeit der Beugung und verbessert damit die Effizienz. Reflexionsbeugungsgitter haben einen festen Winkel, sie können also nur für eine Wellenlänge optimiert werden. Bei VPHs dagegen kann der Winkel gesteuert werden, um die Effizienz für jede Detektionswellenlänge zu optimieren. Dies ergibt eine höhere Transmissionseffizienz für das gesamte Spektrum, insbesondere bei längeren Wellenlängen.

Funktion der VPH-Beugungsgitter im Mikroskop FV3000

Die Verwendung von VPHs in unserer TruSpectral Detektionstechnologie im konfokalen Mikroskop FV3000 beruht auf drei wesentlichen Funktionen (Abbildung 4):

• Eine motorgesteuerte Winkelverstellung des VPH zur automatischen Optimierung des Winkels für die zu erfassenden Wellenlängen.
• Ein verstellbarer motorgesteuerter Lambda-Spiegel, der bestimmte Bereiche des vom VPH erzeugten Spektrums auf die PMT richtet.
• Ein motorgesteuerter Spalt direkt vor der PMT, der von 1 nm bis 100 nm in Schritten von 1 nm verstellbar ist.

Zusammen ermöglichen diese Funktionen eine hochauflösende lineare spektrale Detektion von 400 nm bis 800 nm.

Abbildung 4: Schema des TruSpectral Detektionssystems mit VPH im konfokalem Mikroskop FV3000

Vorteile der TruSpectral Detektion bei der Fluoreszenzbildgebung mit roten Farbstoffen

Das VPH ist nicht nur flexibler, sondern erreicht auch eine deutliche Verbesserung der Übertragungseffizienz des Detektionssystems, insbesondere im erwünschten roten bis tiefroten Fenster (Abbildung 5).

Rotverschobene Farbstoffe werden für Bildgebungsanwendungen immer beliebter, da rotverschobenes Licht weniger phototoxisch ist, tiefer in das Gewebe eindringt und die Multiplexing-Möglichkeiten erweitert. Allerdings sind rote Fluorophore mit herkömmlichen spektralen Detektionsverfahren oft schwer abzubilden, da die Transmissionseffizienz und die spektrale Auflösung von reflektierenden Beugungsgittern und Prismen schlecht ist. Die spektrale Detektion mit VPHs ermöglicht nicht nur eine höhere Transmission von rotem Licht, sondern erhält auch die Präzision und Auflösung des resultierenden Spektrums und ermöglicht eine präzise spektrale Auflösung von 1 nm bis zu 800 nm.

Abbildung 5: Vergleich der Transmissionseffizienz der TruSpectral Detektion im VPH im Mikroskop FV3000 mit den im Mikroskop FV1200 verwendeten reflektierenden Beugungsgittern. Die Verwendung von VPHs führt zu einer bis zu 3-fach höheren Transmission gegenüber herkömmlichen spektralen Detektionsverfahren.

Dank der durch das VPH ermöglichten Verbesserungen konnte das Mikroskop FV3000 als System mit ausschließlich spektraler Detektion entwickelt werden, das heißt, jeder Detektor nutzt die VPH-basierte TruSpectral Detektion (siehe Abbildung 4). Ein System mit ausschließlich spektraler Detektion und unabhängigen Kanälen ermöglicht die Entmischung mehrerer Signale unterschiedlicher Leuchtdichte zur gleichzeitigen Detektion heller und schwacher Fluoreszenz (Abbildung 6).

Abbildung 6: Spektraler „Lambda-Scan“ von COS-7-Zellen mit klarer Trennung stark überlappender Signale

Von der Astronomie bis zur Mikroskopie erweisen sich VPH-Gitter als leistungsfähiges Hilfsmittel zur Durchführung von Spektroskopie-Experimenten. Besuchen Sie uns bald wieder, um unsere nächsten Artikel zu sehen.

Abbildung 7: Vergleich von Spektroskopie-Anwendungen in der Astronomie und Mikroskopie Oben: Spektrale Trennung von Licht, das von verschiedenen Himmelskörpern einer Galaxie ausgesendet wird. Unten: Spektrale Trennung von vier verschiedenen Strukturen innerhalb einer Zelle. Bildquelle (obige Bilder): NASA, ESA, Dan Maoz (Tel Aviv University, Israel und Columbia University, USA)

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