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Note d’application

Numération cellulaire : mesure du nombre de cellules dans les sphéroïdes


L’observation au microscope confocal associée au logiciel d’analyse cellulaire 3D NoviSight permet de compter le nombre de cellules dans des sphéroïdes à partir d’images de coupes optiques des sphéroïdes.

Objectifs

La connaissance du nombre exact de cellules constitue l’un des paramètres les plus importants dans les analyses réalisées sur des cellules. Cela est également le cas pour l’analyse des sphéroïdes. Il est possible de dénombrer les cellules d’un sphéroïde à l’aide d’un hémocytomètre et d’une suspension cellulaire préparée par dissolution du sphéroïde avec de la trypsine, mais cette technique implique la perte des caractéristiques liées à la structure 3D du sphéroïde. Au cours de cette étude, la numération non destructive des cellules des sphéroïdes a été réalisée selon la procédure suivante : le nombre de cellules présentes sur des images de coupes optiques des sphéroïdes a été déterminé par observation au microscope confocal associée à l’utilisation du système d’analyse cellulaire. Les résultats ont été comparés à ceux obtenus avec un hémocytomètre.

Objectifs

Préparation des échantillons

Du milieu de culture a été ensemencé par une suspension de cellules HeLa ou HT-29 dans une microplaque de 96 puits à fond en U PrimeSurface® (SUMITOMO BAKELITE CO., LTD) à raison d’une densité d’ensemencement de 500 cellules/puits. Chaque sphéroïde a été prélevé 48 heures après le début de la culture cellulaire. La moitié du tissu de chaque sphéroïde a été fixée au formol à 4 %. Les tissus fixés ont ensuite été marqués au Hoechst 33342 puis clarifiés toute la nuit.1 La moitié de tissu restante de chaque sphéroïde a été traitée à la trypsine pendant une nuit afin de préparer la suspension cellulaire.

1) Susaki et.al. Cell. 2014 Apr 24;157(3):726-39. doi: 10.1016/j.cell.2014.03.042. Epub 2014 Apr 17

Conclusion
Numération cellulaire réalisée à l’aide du système d’analyse cellulaire et de l’hémocytomètre

Les images en fluorescence des sphéroïdes susmentionnés ont été acquises à l’aide du système d’analyse cellulaire. (Ex : 405 nm, Em : 488 nm). Pour compter le nombre de cellules, le système prend des images de coupes optiques des sphéroïdes tous les 20 µm, puis identifie et compte les noyaux des cellules visibles (figure 1). Ensuite, les nombres de noyaux sont additionnés pour estimer le nombre total de cellules présentes dans le sphéroïde (numération avec le système). Les résultats, présentés dans la figure 2 (barres : écart-type, n=6), ont été comparés à ceux obtenus à l’aide d’un hémocytomètre (comptage manuel). Ces résultats ont montré que le système permet la numération des cellules de sphéroïdes tout en conservant leur intégrité structurelle.

Figure 1: (a)(b)(c)

Figure 1:
(a) Image illustrant l’identification de cellules dans un sphéroïde
(b) Image illustrant l’identification de cellules dans un sphéroïde représenté en pseudocouleurs
(c) Image illustrant l’identification de cellules d'un plan Z dans un sphéroïde

Figure 2: Nombres de cellules dans les sphéroïdes mesurés par le système d’analyse cellulaire ou l’hémocytomètre

Figure 2:
Nombres de cellules dans les sphéroïdes mesurés par le système d’analyse cellulaire ou l’hémocytomètre

PrimeSurface est une marque déposée de Sumitomo Bakelite Co., Ltd.
Olympus est une marque déposée, et NoviSight, Insightful Analysis et Intelligent Answers sont des marques de commerce d’Olympus Corporation.

Appareil requis pour cette application

Logiciel d’analyse cellulaire 3D

NoviSight

  • Identification de la structure d’ensemble jusqu’à la structure infracellulaire via l’image 3D
  • Analyse statistique
  • Grande variété d’analyses par défaut

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