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Notas de aplicação

Contagem de células — Medindo o número de células em esferoides


A observação confocal combinada com o sistema de análise de imagens celulares permite aos usuários contar o número de células em esferoides usando imagens em corte transversal de esferoides.

Objetivos

Saber o número de células é um dos parâmetros mais importantes em ensaios com células, e isso também ocorre na análise de esferoides. A contagem de células com um hemocitômetro requer uma suspensão de células preparada usando uma dissolução esferoidal com tripsina. Se isso for feito, no entanto, as características dos esferoides originados em sua estrutura 3D serão perdidas. Neste estudo, a contagem não destrutiva de células em esferoides foi realizada da seguinte forma: o número de células em imagens em corte transversal de esferoides foi medido por meio da observação confocal combinada com o uso do sistema de análise celular. Os resultados foram comparados aos obtidos com um hemocitômetro.

Objectives

Preparação de amostras

Foi semeada uma suspensão de células HeLa, ou HT-29, em uma placa PrimeSurface® 96U (SUMITOMO BAKELITE CO., LTD) a 500 células/poço. Cada esferoide foi colhido 48 horas após o início da cultura de células. Metade de cada esferoide foi fixada em formalina a 4% seguida de coloração com Hoechst 33342 e transparência1 de um dia para o outro. A parte restante de cada esferoide foi tratada com tripsina de um dia para o outro para preparar a suspensão de células.

1) Susaki et.al. Cell. 24 de abril 2014; 157(3):726-39. doi: 10.1016/j.cell.2014.03.042. Epub 17 de abril de 2014.

Conclusão
Contagem de células com o sistema de análise celular e hemocitômetro

Foram obtidas imagens fluorescentes dos esferoides mencionados acima usando o sistema. (Ex: 405 nm, Em: 488 nm). Para contar as células, o sistema adquire imagens em corte transversal de esferoides a cada 20 μm e, em seguida, identifica e conta as células visíveis (Figura 1). Em seguida, o número de núcleos é somado para estimar o número total de células em todo o esferoide (contagem do sistema). Os resultados foram comparados aos obtidos com um hemocitômetro (contagem manual), conforme mostrado na Figura 2 (barras: DP, n=6). Esses resultados mostraram que o sistema permite a contagem de células em esferoides, mantendo sua integridade estrutural e sem precisar dissolver os esferoides com tripsina.

Figure 1: (a)(b)(c)

Figure 1:
(a) Image of cell identification in a spheroid
(b) Image of cell identification in a spheroid displayed in pseudo colors
(c) Image of cell identification at the Z position in a spheroid

Figure 2: Numbers of cells in spheroids measured by the system or hemocytometer

Figure 2:
Numbers of cells in spheroids measured by the system or hemocytometer

PrimeSurface é uma marca registrada da Sumitomo Bakelite Co., Ltd.
Olympus é uma marca registrada e NoviSight e Insightful Analysis, Intelligent Answers são marcas da Olympus Corporation.

Produtos usados nesta aplicação

Software de análise celular 3D

NoviSight

  • Reconhecimento de imagem 3D de toda a estrutura até o subcelular
  • Análise estatística
  • Variedade de ensaios padrão

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