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CM20 배양 모니터링 시스템을 이용한 인간 iPS 세포주 비교 3부: 여러 iPS 세포주 사이에서 간 오가노이드의 분화 효율성 차이 줄이기


서문

오가노이드는 체외에서 인간의 유도 만능 줄기(iPS) 세포로 생성할 수 있는 3차원 조직입니다. 각각의 다른 환자들로부터 유래된 오가노이드들은 기능 및 독립된 차별성들의 위한 연구에 사용될 수 있습니다. 이연구의 목적은 CM20인큐베이션 모니터링 시스템을 사용하여 오가노이드 형성 효율 확인을 위해 공여자 와 클론종속성을 검토, 형태 측정학적 차이를 확인하기 위함입니다.

CM20으로 각각의 인간 유래 iPS 세포들의 분열증식 분석 데이터를 확인

우리의 초기 연구에서, 다양한 공여자로부터 유래된 12개의 인간 iPS 세포주는 분화되지 않은 상태로 유지된 채 Olympus CM20 시스템을 사용하여 모니터링 되었습니다. 장기간의 정량적 세포 상태 모니터링을 통해, 우리는 특정한 iPS 세포주 passage 성장 과정과 성장속도 불안정성의 차이가 있음을 발견하였습니다.

연구 다음 단계에서는 12개의 인간 iPS 세포주를 간 오가노이드로 분화하고 이러한 iPS 세포주 사이에 오가노이드 형성 가변성과 분화 효율성이 있는지 알아보았습니다. 오가노이드로의 후속 분화 효율성이 유지 배양 중 초기 단계 증식에서의 차이로 커다란 영향을 받는다는 점을 밝혀냈지만, 형성된 간 오가노이드의 품질이 좋은지 나쁜지는 iPS 세포주 간 Doubling time(분열시간)의 차이로 판단할 수 없었습니다.

여기서 더 나아가 간 오가노이드 분화 방법을 개선하기 위해, 연구 첫 번째 단계의 유지 배양 중에 CM20으로 확인한 Cell growth(세포성장) 데이터를 사용했습니다. 특정 iPS 세포주간 오가노이드 분화 효율성이 낮은 두 개의 특정한 iPS 세포주에 초점을 맞춰 이들 세포주가 다른 세포주에서 다른 방법으로 작용하는 방법을 연구하기로 했습니다. 유지 배양 조건을 수정하여 분화 저항 iPS 세포의 분화 효율성을 개선할 수 있는지 알아보았습니다.

결과

지금까지 시험한 12개의 iPS 세포주 중에서 세포주 I 및 J가 간 계통 분화에 대한 내성이 있음을 발견했습니다. 그 이유를 더 잘 이해하기 위해 초기 단계의 유지 배양 중 CM20에서 확보한 일련의 이미지를 사용했고, 간 계통으로 효율적으로 분화될 수 있는 iPS 세포주와 비교하여 세포주 I 및 J의 작용 차이를 발견하려고 했습니다.

흥미롭게도, 분화 가능한 iPS 세포주(예: 세포주 L)에서는 증식 초기 단계의 배양 후 고착된 대부분의 단일 세포에서 콜로니가 형성되었습니다. 한편 세포주 I 및 J의 고착 후 세포사 비율이 더 높아졌고, 그로 인해 콜로니 형성 효율성이 크게 감소했음이 관찰되었습니다(그림 1). 이러한 경향은 다양한 경과에서 반복적으로 관찰되었습니다. 관찰 후, 분화 내성 iPS 세포주의 유지 배양 초기 단계에서 더 높은 빈도의 세포사가 더 낮은 수의 iPS 세포 콜로니를 유발하고, 이로 인해 궁극적으로 간 오가노이드로의 분화 효율성이 줄어든다는 가설을 내렸습니다.

이를 시험하기 위해 배양하는 시드 세포의 수를 늘려 최종 콜로니 수가 분화 가능한 iPS 세포주의 수와 동일하도록 했습니다. 그런 다음 이 배양 과정으로부터 간 오가노이드 분화를 유도하려 했습니다. 배양하는 시드 세포의 수를 5~10배 늘리면 분화 저항 iPS 세포의 유지 배양에서 형성되는 콜로니 수가 표준 프로토콜에 비해 늘어난다는 점을 확인했습니다(그림 2A). 또한, 이러한 조건에서 세포주 I 및 J로부터 간 오가노이드를 생성하면 오가노이드가 거의 형성되지 않았던 이전 조건과 달리 충분한 수의 오가노이드가 나왔습니다(그림 2B). 이러한 간 오가노이드가 여러 가지 간 기능 수치를 표현한다는 것도 발견했습니다. 이 결과는 초기 단계의 분화 저항 iPS 세포의 유지 배양과 간 오가노이드로의 후속 분화를 개선하는 CM20 세포 배양 모니터 데이터의 유용성을 강조합니다.

세포주 I

세포주 I

세포주 J

세포주 J

세포주 L

세포주 L

그림 1.유지 배양 초기 단계에서의 인간 iPS 세포주 작용

(A) 정상 조건에서의 3개의 인간 iPS 세포주 성장 과정 및 시드 세포 수가 늘어난 조건에서의 유지 배양에 대한 CM20 모니터링 결과

(B) 시드 세포 수가 늘어난 조건에서 분화 저항을 보이는 세포주 I 및 J에 대한 유지 배양 후 분화 유도가 수행될 때의 오가노이드 형성 모습 비교를 위해, 분화 능력이 있음이 확인된 L 세포주가 정상 조건에서 유지 및 배양되고 분화가 유도될 때의 오가노이드도 표시했습니다.

그림 2. iPS 세포의 유지 배양 중 오가노이드 형성에 대한 시딩 밀도의 영향
(A) 인간 iPS 세포주 3개의 정상 조건 하 성장 과정 및 시드 세포 수가 늘어난 조건 하의 유지 배양에 대한 CM20 모니터링 결과
(B) 시드 세포 수가 늘어난 조건에서 분화 저항을 보이는 세포주 I 및 J에 대한 유지 배양 후 분화 유도가 수행될 때의 오가노이드 형성 비교를 위해, 분화 능력이 있는 iPS 세포주인 L 세포주에서 유래한 오가노이드는 L 세포주가 표준 조건을 유지하고 분화를 유도할 때 표시됩니다.

결론

오가노이드를 다루는 연구자들은 종종 iPS 세포에서 오가노이드 분화 프로토콜을 최적화하는 데 대부분의 노력을 집중합니다. 여러 iPS 세포주에서 유래한 오가노이드를 비교할 때, 대부분의 연구자들은 유지 배양에 거의 관심을 기울이지 않습니다. 이 연구는 iPS 세포의 유지 배양 중 초기 단계의 증식이 후속 분화 유도 효율성에 커다란 영향을 준다는 사실을 밝혀냈습니다. 이는 오가노이드 분화를 위한 프로토콜 개발 외에도 개별 iPS 세포 유지 배양 프로토콜의 최적화가 여러 오가노이드 샘플의 재현 가능한 생성에 중요함을 시사합니다. 종단면 타임 시리즈 배양 데이터의 보관 및 정량적 처리가 가능한 CM20 모니터링 시스템을 사용하면 새로운 통찰력을 얻고 실험 프로토콜을 개선할 수 있습니다. 

Takebe 박사와 Yoneyama 박사의 의견

Takanori Takebe 박사(왼쪽), Yosuke Yoneyama 박사(오른쪽)

Takanori Takebe 박사(왼쪽)
Yosuke Yoneyama 박사(오른쪽)
도쿄 의과치과대학
연구소

CM20 모니터링 시스템의 유용한 기능으로는 오가노이드 결과를 즉시 과거의 이미지 스택과 연결하여 iPS 세포 상태를 평가할 수 있다는 것이 있습니다. iPS 세포를 유지하는 중에 조건을 알려주고 분화 효율성을 개선하는 중요한 특성을 확인할 수 있다는 것은 우리 실험실에 있어 대단한 이점이었습니다.

이 애플리케이션에 사용되는 제품

배양 모니터링 시스템

CM20

  • 정량 데이터 자동 측정
  • PC 또는 태블릿에서 원격으로 배양 진행 상황 모니터링
  • 소형 디자인용 사선 에피 조명을 갖춤
배양 모니터링 시스템

CM30

자동화된 CM30 배양 모니터링 시스템에서 제공하는 신뢰할 수 있는 정량 데이터를 사용하여 세포 배양’ 상태, 세포 수 및 융합도를 원격으로 모니터링, 분석 및 공유합니다. 이 시스템을 사용하면 라벨 없는 관찰이 가능하고, 세포 배양 손상 위험이 감소하며, 배양 작업 흐름을 표준화 할 수 있습니다.

  • 세포 배양의 상태 및 융합도에 관한 정량 데이터 를 자동으로 수집
  • PC 또는 태블릿을 통해 원격으로 배양 진행 상황을 모니터링, 분석 및 공유
  • 라벨 없는 관찰을 위한 경사 입사 백색 광원 적용

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