홈/ 어플리케이션 노트FLUOVIEW FV3000 공초점 현미경을 사용한 스페로이드의 3D 저속 촬영 이미징: 항체 의존적 세포매개 세포독성(ADCC)의 48시간 연속 관찰

FLUOVIEW FV3000 공초점 현미경을 사용한 스페로이드의 3D 저속 촬영 이미징: 항체 의존적 세포매개 세포독성(ADCC)의 48시간 연속 관찰

항체 의존적 세포매개 세포독성(ADCC)은 항체 약제의 작용 메커니즘의 하나입니다. 내추럴 킬러(NK) 세포 및 단핵 백혈구 같은 주효 세포는 항체로 결합된 표적 세포(예: 암세포)를 인식합니다. 주효 세포는 항체를 인식한 후 세포 용해를 유도하는 갑상샘 세포독성인자를 방출하여 표적 세포를 파괴합니다. 이 애플리케이션에서는 인체 EGFR 대상 치료용 단일클론 항체가 있는 데서 기능성 Fcgamma(FCγ) 수용체를 발현하는 인간 결장 암세포(HT-29) 및 NK 세포(KHYG-1)를 사용하여 3D 공동 배양 실험을 수행하고 FLUOVIEW FV3000 컨포칼 현미경을 사용하여 48시간 동안 이를 관찰하였습니다. ADCC의 결과적 3차원(3D) 이미징을 통해 NK 세포가 암세포를 공격하는 방법을 캡처할 수 있었습니다.

광독성이 감소된 3D 라이브 셀 스페로이드 이미징

3D 배양 시스템(스페로이드라고 함)에서 생장한 세포 질량은 질량의 두께로 인해 이미지를 획득하기 어렵습니다. 검출될 만큼 강한 형광 신호를 생성하기 위해 더 높은 여기광 강도가 필요합니다. 하지만 여기광이 더 높을수록 광독성이 증가되어 세포가 손상됩니다. 이에 대처하기 위해 약한 형광 신호를 캡처하고 스페로이드 내 심도 있는 신호 생성에 필요한 레이저 파워를 최소화하도록 Olympus의 TruSpectral 검출 기술을 결합하는 FV3000 현미경을 사용하였습니다. 또한 심도 있는 관찰을 위한 고해상도로 더 밝은 이미지를 획득하기 위해 60X 실리콘 오일 이멀젼 대물렌즈(라이브 셀의 굴절률과 긴밀히 일치)를 사용하였습니다. 스페로이드가 NK 세포 매개 HT-29 세포 죽음으로 인해 허탈 상태(collapsed)가 되었기 때문에 이러한 두 기술을 결합하여 48시간 동안 스페로이드의 밝은 3D 타임 랩스를 성공적으로 캡처하였습니다.

그림 1: 48시간 동안 스페로이드 HT-29 종양 세포를 공격하는 3D 이미징 NK 세포에 의해 획득된 동영상

HT-29 세포(결장암에서 추출된 세포계)의 스페로이드로 기능성 Fcgamma(FCγ) 수용체 및 ZsGreen 형광 단백질을 발현하는 NK 세포계 KHYG-1(녹색)를 배양하였습니다. HT-29 세포의 표면을 항 EGFR 단일클론 항체 세툭시맙(Alexa Fluor 647, 파란색)으로 표지하였습니다. 프로피듐 요오드화물(PI)이 있는 데서 HT-29 및 NK 세포를 배양하고 48시간 동안 XYZT 이미징을 수행하였습니다. 핵 표지된 빨간색(PI의 세포 흡수 표시)이 세포 죽음의 지표로 사용되었습니다

이미징 조건
대물렌즈: 60X 실리콘 오일 이멀젼 대물렌즈(UPLSAPO60XS)
현미경: FLUOVIEW FV3000 시스템
레이저: 488nm(ZsGreen, 녹색), 561nm(PI, 빨간색), 640nm(Alexa Fluor 647, 파란색)

Z-드리프트보상 시스템으로 정확한 타임 랩스 이미징이 가능합니다

항체 약제의 효과를 평가하는 실험에 라이브 셀의 장기 이미징은 필수적입니다. NK 세포가 스페로이드 암세포에 미치는 영향을 더 정밀하게 캡처하기 위해 Z-드리프트보상기(IX3-ZDC2)를 사용하여 온도 변화 같은 외부 환경 변화로 인한 초점의 변경을 방지하였습니다. IX3-ZDC2를 통해 스페로이드에 대한 초점을 잃지 않고 장기간에 걸쳐 타임 랩스 이미지를 획득할 수 있었습니다. 이를 통해 NK 세포가 종양 질량에 공격을 가하고 들어가면서 모양을 적극적으로 변경하는 것을 확인할 수 있었습니다.

그림 2: 세툭시맙(파란색)으로 표지된 HT-29 종양 세포에 공격을 가하고 들어가면서 모양을 변경하는 NK 세포계 KHYG-1(녹색). PI 흡수(빨간색)는 세포 죽음을 가리킵니다.

11h

그림 2: 세툭시맙(파란색)으로 표지된 HT-29 종양 세포에 공격을 가하고 들어가면서 모양을 변경하는 NK 세포계 KHYG-1(녹색). PI 흡수(빨간색)는 세포 죽음을 가리킵니다. 17h

17h

그림 2: 세툭시맙(파란색)으로 표지된 HT-29 종양 세포에 공격을 가하고 들어가면서 모양을 변경하는 NK 세포계 KHYG-1(녹색). PI 흡수(빨간색)는 세포 죽음을 가리킵니다. 22h

22h

그림 2: 세툭시맙(파란색)으로 표지된 HT-29 종양 세포에 공격을 가하고 들어가면서 모양을 변경하는 NK 세포계 KHYG-1(녹색). PI 흡수(빨간색)는 세포 죽음을 가리킵니다. 24h

24h

FV3000 컨포칼 현미경에 의한 실험 촉진 방법

전체 스펙트럼 시스템이 고감도를 제공합니다

FV3000 시리즈는 부피 위상 홀로그램 장치를 사용하여 전송을 통해 빛을 회절시키는 Olympus의 TruSpectral 검출 기술을 이용합니다. 이 기술은 반사 유형 격자가 장착된 기존 스펙트럼 검출 장치와 비교하여 빛 처리량이 훨씬 더 높으며 심도 있는 조직 관찰에 필요한 레이저 파워를 최소화합니다.

Z-드리프트보상(ZDC) 시스템으로 초점 유지

IX3-ZDC2 Z-드리프트 보상기는 광독성이 최소인 적외선(레이저 등급 1)을 사용하여 샘플 평면의 위치를 식별합니다. 원샷 자동초점(AF) 모드는 심도 있는 샘플에 대해 원하는 대로 여러 초점 위치를 설정하여 다위치 실험에서 효율적인 Z 스택 획득을 가능하게 합니다.

라이브 셀 이미징용 실리콘 이멀젼 대물렌즈가 심도 있는 고해상도 관찰을 제공합니다

실리콘 오일의 굴절률(ne≈1.40)은 살아있는 조직의 굴절률(ne≈1.38)에 가까우므로 굴절률 불일치에 의해 야기된 최소 구면 수차로 살아있는 조직 내 심도 있는 관찰을 가능하게 합니다. 또한 실리콘 오일은 고갈되거나 경화되지 않으므로 오일을 재충전할 필요가 없으며 연장된 타임 랩스 관찰에 이상적입니다.

Dr. Yuji Mishima의 견해

Dr. Yuji Mishima

특히 스페로이드 세포를 사용하여 항체 의학의 효과를 입체 구조적으로 평가하는 데 필요한 실험의 수에서 보듯이 최근 수년간 암 연구에서 형광 이미징의 수요가 증가하고 있습니다. 스페로이드는 그 두께로 인해 형광을 사용하여 관찰하기 매우 어렵지만 FV3000 현미경을 사용하여 48시간 전체에 걸쳐 스페로이드 암세포를 관찰할 수 있었습니다. ADCC 실험 내내 살아있는 암세포, 죽은 세포 및 주효 세포(NK 세포)가 항체 치료에 반응함에 따라 이들 세포를 정확히 측정할 수 있었습니다. FV3000가 항체 의학의 치료 효과를 평가하는 데 매우 효과적이었다고 생각합니다.

감사의 말
이 애플리케이션 노트는 다음 연구원들의 도움으로 작성되었습니다.
JFCR의 암 화학요법 센터, Dr. Yuji Mishima