컨포칼 현미경의 검출 방법
컨포칼 현미경은 두꺼운 조직 표본의 단백질 발현 및 상호작용을 검사하는 전형적인 기법입니다. 전체 시야(초점면 밖의 광자 포함)에서 방출된 광자를 캡처하는 광시야 에피 형광 현미경과 대조적으로 컨포칼 현미경은 초점면에 결합된 핀홀을 사용하여 초점이 맞지 않는 빛을 거부하고 초점이 맞는 조직의 평면으로만 시각적으로 절편된 이미지를 생성합니다.
컨포칼 방법은 두꺼운 샘플의 선명한 고해상도 이미지를 획득하는 데 효과적이지만 핀홀에서의 내재적 광손실로 인해 신호-노이즈 비율이 높은 이미지를 캡처하는 것이 어렵게 됩니다. 이 때문에 현미경의 광학 트레인의 나머지가 이미지를 획득하고 방출된 광자를 최대한 많이 검출하는 데 필요한 레이저 노출을 최소화하는 데 매우 효율적인지 확인하는 것이 중요합니다.
필터 및 스펙트럼 광 검출 기법 간 차이
필터 기반 검출에서는 광전자 증배관(PMT) 앞에 대역통과 필터를 놓고 검출기로 향하는 광파장을 선택합니다. 스펙트럼 기반 검출에서는 격자 또는 프리즘을 사용하여 방출광의 스펙트럼을 생성하면 검출하고자 하는 방출 스펙트럼의 밴드(들)를 미세 조정할 수 있습니다.
또한 스펙트럼 기반 검출을 사용하면 특정 대역폭 및 단계 크기에서 방출광의 전체 스펙트럼을 표시할 수 있는 “람다 스캔”을 수행할 수 있습니다.
스펙트럼 기반 검출 방법을 사용하면 더 유연한 실험이 가능하지만, 전통적으로 감도 면에서 절충이 있었습니다. 스펙트럼 기반 검출은 더 큰 유연성을 제공하지만 필터 기반 검출은 일반적으로 더 효율적입니다.
현미경 분광학의 근원
스펙트럼을 생성하기 위해 스펙트럼 검출 기술은 반사형 회절 격자 및 프리즘 기반 시스템 등 두 가지 방법에 의존하였습니다. 반사 기술은 1990년대 후반에 최초 시판된 컨포칼 현미경으로 첫선을 보였습니다(그림 1). 그 후 얼마되지 않아 프리즘 기반 컨포칼 시스템의 이용이 가능하게 되었습니다.
위에서 언급한 바와 같이, 스펙트럼 검출 방법은 필터 기반 방법과 비교하여 덜 효율적인 경향이 있습니다. 이러한 효율 차이에는 다음 세 가지 요인이 있습니다.
- 고차 회절의 상실: 빛이 회절 격자에서 반사될 때 여러 회절 차수가 생성됩니다. 1차 회절만이 검출 경로를 통과하기 때문에 더 높은 회절 차수는 상실됩니다.
- 편광 의존적 상실: 빛의 반사는 반사 격자에 대해 P-편광의 회절 효율이 S-편광의 회절 효율보다 적기 때문에 편광 상태에 따라 다릅니다.
- 반사 격자의 파장 의존적 효율: 회절 효율이 특정 파장의 최대치에 달하면 더 높거나 더 낮은 파장의 효율이 저하됩니다.
반사형 회절 격자는 이러한 세 가지 모든 요인의 영향을 받으며 스펙트럼 검출의 최소 효율적 방법입니다. 프리즘 기반 검출 방법은 고차 회절 빛의 상실 문제를 해결하지만 더 긴 파장에서 스펙트럼 해상도가 영향을 받습니다. 이러한 문제점 때문에 어느 기술도 필터 기반 검출 시스템의 요구를 완전히 대체할 수 없었습니다.
그림 1: 컨포칼 현미경 및 스펙트럼 기반 검출 기술의 타임라인
부피 위상 홀로그램: 격자에 대한 다른 접근법
약 20년 동안 반사형 회절 격자 및 프리즘 기반 기술이 모든 제조업체에 걸쳐 컨포칼 현미경에서 대부분의 분광학 애플리케이션을 지원하였습니다. 하지만 현미경이 이미지 형성의 수단으로 분광학에 의존하는 유일한 분야가 아닙니다. 천문학도 이에 해당합니다. 천문학 분광학은 천문학적 관심 개체(예: 은하계 및 기타 천체)도 자외선에서 적외선까지 빛을 방출하며 천문학자들이 이러한 구성요소를 차별화하여 정확한 이미지를 구성할 수 있어야 한다는 점에서 현미경 분광학과 비슷합니다(그림 2).
그림 2: 은하계의 이미지를 구성하기 위해 천문학에서의 분광학 응용
제공: NASA, ESA, Dan Maoz(이스라엘 텔아비브 대학, 미국 콜롬비아 대학)
이를 수행하기 위해 천문학자들이 사용하는 주요 기술의 하나는 부피 위상 홀로그램(VPH)입니다. 스펙트럼 광을 생성하기 위해 표면 부조 격자에서 빛을 반사하는 대신에 VPH 격자는 격자를 통해 빛을 통과시켜 입사광을 스펙트럼 구성요소 안으로 회절시키는 전달 방법을 사용합니다(그림 3). VPH 격자를 사용하는 천문학 실험은 2000년에 처음 발표되었으며, 이 기술은 빠르게 채택되었습니다. 그 후 세계 최대의 일부 실험실에서 분광학에 대해 거대 규모의 VPH 격자가 성공적으로 구현되었습니다.
그림 3: 표면 부조 격자 및 부피 위상 홀로그램 격자에 의한 회절의 메커니즘의 횡단면 다이어그램 표면 부조 격자(좌측)가 격자 표면에서 빛을 반사하는 반면, VPH 격자(우측)는 격자를 통해 빛을 전달합니다.
2016년에 투과형 빛의 회절을 가능하게 하는 TruSpectral™ 검출 기술을 이용한 FLUOVIEW™ FV3000 컨포칼 현미경의 시판으로 최초로 상용 현미경에 VPH 기술이 구현되었습니다. 현미경에 VPH 격자의 사용 이점:
- 낮은 편광 감도
- 낮은 산란(고효율)
- 스펙트럼 전체에 걸친 높은 투과(반사형 회절 격자와 비교하여 특히 적색에서)
- 필터보다 더 유연함
TruSpectral 기술은 투과형 회절 격자를 사용하기 때문에 기존 스펙트럼 검출 방법과 일반적으로 연관된 많은 문제를 해결합니다. 예를 들어 일반적으로 반사형 회절 격자에 발생하는 상당한 상실과 비교하여 편광 의존적 상실이 최소화됩니다. 또한, VPH는 회절 효율의 파장 의존을 제거합니다. 반사형 격자가 하나의 파장에만 최적화될 수 있도록 고정 각도를 가지는 반면, VPH의 각도는 검출 파장에서 효율을 최적화하도록 제어될 수 있습니다. 이에 따라 스펙트럼 전체에 걸쳐 특히 파장이 길수록 투과 효율이 높아질 수 있습니다.
FV3000 현미경에서 VPH 격자의 작동 방법
FV3000 컨포칼 현미경에서 TruSpectral 검출 기술의 VPH 사용은 세 가지 주요 기능에 의존합니다(그림 4):
- 검출 중인 빛의 파장에 대해 각도를 자동으로 최적화하기 위한 VPH의 전동식 각도 조정
- VPH에 의해 생성된 스펙트럼의 특정 영역을 PMT로 향하게 하는 데 사용되는 조절 가능한 전동식 람다 미러
- 중간의 단계 크기가 1nm이고 1nm에서 100nm까지 자유로이 조절될 수 있는 PMT 바로 앞의 전동식 조절 가능 슬릿
이들 기능을 결합하여 400nm-800nm의 고행상도 선형 스펙트럼 검출이 가능합니다.
그림 4: FV3000 컨포칼 현미경의 VPH 기반 TruSpectral 검출 시스템의 다이어그램
적색 염료를 사용한 형광 이미징을 위한 TruSpectral 검출의 이점
VPH는 유연성을 증가시킬 뿐 아니라 원하는 적색부터 원적색 창에서 특히 검출 시스템의 투과 효율을 상당히 향상시킵니다(그림 5).
적색 이동 빛이 광독성이 더 적고 조직 내 심도 침투를 더 높일 수 있으며 다중화 기능을 확대하기 때문에 이미징 응용에 적색 이동 염료의 인기가 더 높아지고 있습니다. 하지만 반사형 회절 격자 및 프리즘의 투과 효율 및 스펙트럼 해상도가 낮기 때문에 적색 형광단은 기존 스펙트럼 기반 이미징 기술을 이용하여 이미지를 획득하기가 종종 어렵습니다. VPH 기반 스펙트럼 검출은 적색 빛의 투과를 더 높게 해줄 수 있을 뿐 아니라 결과로 초래된 스펙트럼의 정밀도 및 해상도를 유지하여 정밀한 1nm 스펙트럼 해상도를 800nm까지 완전히 가능하게 합니다.
그림 5: FV1200 현미경에 사용된 반사 기반 회절 대 FV3000 현미경의 VPH 기반 TruSpectral 검출 기술의 투과 효율의 비교. 기존 스펙트럼 검출 방법과 비교하여 최대 3배 높은 투과를 제공합니다.
VPH 격자에 의해 가능해진 개선을 통해 FV3000 현미경을 전체 스펙트럼 기반 시스템으로 설계하고 제작할 수 있게 되었습니다. 즉 그림 4에 표시된 바와 같이 모든 검출기가 VPH 기반 TruSpectral 검출 기술을 이용합니다. 독립 채널 기반의 전체 스펙트럼 시스템을 사용하면 밝은 형광과 어두운 형광의 동시 검출을 위한 다양한 강도의 여러 신호들의 혼합을 분류할 수 있습니다(그림 6).
그림 6: COS-7 세포의 스펙트럼 “람다 스캔”이 고도로 중첩된 신호를 명확히 분리합니다
천문학에서 현미경까지, VPH 격자는 분광학 실험을 수행하기 위한 강력한 도구임을 입증하고 있습니다. 다음 내용을 확인하기 위해 채널 고정하세요.
그림 7: 천문학 대 현미경의 분광학 응용 비교. 상단: 은하계 내의 각기 다른 천체에서 방출된 빛의 스펙트럼 분리. 하단: 세포 내의 4개 구조의 스펙트럼 분리 상단 이미지 제공: NASA, ESA, Dan Maoz(이스라엘 텔아비브 대학, 미국 콜롬비아 대학)
