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Notas de aplicação

Imagem de alta resolução de interações de células ósseas usando o microscópio confocal FLUOVIEW FV3000 e uma objetiva de imersão em óleo X Line 40X


O osso remodela-se constantemente usando um equilíbrio entre reabsorção óssea osteoclástica e formação óssea osteoblástica. No entanto, certos fatores de saúde podem causar um desequilíbrio, ocasionando ossos quebradiços em doenças ósseas, como a osteoporose. Para entender o mecanismo de remodelação óssea, é importante observar as interações entre osteoclastos e osteoblastos.

Neste estudo, preparamos uma seção tibial de rato (Figura 1) e observamos de perto os osteoclastos e osteoblastos na zona de fronteira entre a medula óssea e o osso cortical. Essa aplicação normalmente requer o uso de uma objetiva de baixa ampliação para capturar um amplo campo de visão para identificar uma região de interesse, seguido pelo uso de uma objetiva de imersão em óleo de alta ampliação para observar os detalhes em uma resolução mais alta. No entanto, essa abordagem pode ser difícil, pois você pode perder a região de interesse ao mudar de objetiva.

Aqui, encontramos a região de interesse em um amplo campo de visão e observamos as estruturas finas em alta resolução usando apenas uma objetiva de imersão em óleo 40X sem mudar de objetiva.

Figura 1: Seção tibial
Figura 1: Seção tibial

Imagem de alta resolução de interações de células ósseas usando uma objetiva de imersão em óleo da X Line 40X (UPLXAPO40XO)

Observamos a zona limítrofe entre a medula óssea e o osso cortical em uma seção tibial de rato, bem como o contato local (*na Figura 2a) de osteoblastos (verde) com células endoteliais vasculares (amarelo) e local de interação (# na Figura 2a) de osteoblastos com osteoclastos (vermelho). O amplo campo de visão da objetiva em óleo 40X nos permitiu adquirir uma imagem que mostra onde a imagem de alta ampliação está localizada na região de interesse (imagem da Figura 2a).

Com o zoom de varredura, pudemos observar de perto o local de interação dos osteoblastos com os osteoclastos (Figura 2b). A qualidade da imagem obtida com a objetiva UPLXAPO40XO da X Line foi quase a mesma que a obtida com a objetiva convencional UPLSAPO60XO (Figura 2c).

Figura 2: Imagens fluorescentes de uma seção tibial de rato

Figura 2: Imagens fluorescentes de uma seção tibial de rato
Imagem obtida usando o zoom de varredura 1x com uma objetiva UPLXAPO40XO
Imagem obtida usando o zoom de varredura 3,45x com uma objetiva UPLXAPO40XO
Imagem obtida com o zoom de varredura de 2,03x com uma objetiva UPLSAPO60XO

Condições de imagem
Microscópio: sistema FV3000
Objetiva: UPLXAPO40XO (UPLSAPO60XO usada para referência)
Lasers: 488 nm (Alexa Fluor 488, verde), 561 nm (Alexa Fluor 568, vermelho), 640 nm (Alexa Fluor 647, amarelo)


Como o microscópio confocal FV3000 facilitou nossa experiência

Imagens de alto desempenho com objetivas X Line

A alta abertura numérica (AN) das objetivas X Line permite maior ganho de luz para obter imagens mais brilhantes e de alta resolução.

Leia um artigo acadêmico sobre as objetivas X Line

Imagens de alto desempenho com objetivas X Line

Adquira imagens de alta relação sinal-ruído (SNR) sob pouca luz de excitação

Usando a tecnologia exclusiva de detecção espectral, os detectores TruSpectral do microscópio confocal FV3000 combinam alta sensibilidade com flexibilidade espectral para detectar até mesmo fluoróforos escuros. Os detectores TruSpectral incorporam até quatro canais de tubos fotomultiplicadores GaAsP (PMTs) com eficiência quântica de até 45%, permitindo que os usuários visualizem amostras muito escuras para serem visualizadas em equipamentos convencionais. O resfriamento Peltier reduz o ruído de fundo em 20% para imagens SNR altas sob luz de excitação muito baixa. Adquira imagens de alta relação sinal-ruído (SNR) sob pouca luz de excitação

Comentário da Dra. Yukiko Kuroda

Dra. Yukiko Kuroda

Era difícil encontrar os locais de interação durante a geração de imagens em alta resolução de interações osteoclastas e osteoblásticas ao alternar entre uma objetiva seca de baixa ampliação para amplo campo de visão e uma objetiva UPLSAPO60XO para imagens de alta resolução. Outro desafio foi adicionar óleo durante o processo de geração de imagens. Quando usamos a objetiva UPLSAPO60XO para todo o processo de criação de imagens, demorou muito tempo para encontrar a região de interesse devido ao campo de visão estreito.

Este estudo demonstra que conseguimos encontrar com êxito os locais de interação e obter imagens de alta resolução equivalentes às capturadas com a objetiva UPLSAPO60XO usando apenas uma objetiva de imersão em óleo 40X (UPLXAPO40XO) com uma abertura numérica alta (NA) equivalente a UPLSAPO60XO. Como resultado, pudemos observar com eficiência as interações entre osteoclastos e osteoblastos usando apenas o objetivo UPLXAPO40XO.

Agradecimentos
Esta nota de aplicação foi preparada com a ajuda do Dra. Yukiko Kuroda. Ela é instrutora da Keio University e é responsável pelas imagens deste estudo

Produtos usados nesta aplicação

Microscópio de escaneamento a laser confocal

FV3000

  • Disponível para configurações de escâner híbrido galvanômetro/ressonante (FV3000RS) ou apenas galvanômetro (FV3000)
  • Detecção TruSpectral extremamente precisa e eficiente em todos os canais
  • Otimizado para imagem de célula viva com alta sensibilidade e baixa fototoxicidade
  • Inverted and upright frame options to suit a variety of applications and sample types
Objetivas apocromáticas estendidas

UPLXAPO

  • Grande abertura numérica, nivelamento de imagem homogêneo e compensação de aberração cromática de 400 nm a 1.000 nm.
  • Imagem de precisão altamente confiável para aplicações amplas de microscopia de campo claro/fluorescência a microscopia confocal/superresolução.

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