Os sistemas de microscopia atuais capturam sistemas complexos com alta precisão, tornando-os fundamentais para pesquisadores de Ciências da vida que buscam entender os mecanismos biológicos. Entretanto, seu microscópio deve funcionar de forma consistente para produzir dados reprodutíveis, assim como qualquer equipamento de laboratório para pesquisa.

Essa questão representa um desafio à medida que os equipamentos de microscópio e as análises de imagens se tornam cada vez mais complexos.

Neste post, examinamos mais de perto a importância de monitorar o desempenho do microscópio e compartilhamos como as ferramentas analíticas podem ajudar a identificar problemas que causam parcialidade nos seus resultados.

Como a parcialidade pode interferir em dados experimentais

A parcialidade pode facilmente interferir no seu experimento a partir de várias origens. Por exemplo, vejamos uma análise morfológica. Ao procurar medir alterações na estrutura celular, é necessário obter imagens e medir as diferenças morfológicas. Mesmo que seu microscópio esteja funcionando como deveria, pode ocorrer parcialidade nas suas imagens e nos resultados subsequentes devido à preparação da amostra ou às variações biológicas dela. Isso representa um desafio para adquirir dados precisos e reprodutíveis.

Agora imagine que esta tarefa tenha sido realizada usando um microscópio não calibrado. Mais parcialidade seria introduzida na imagem do próprio microscópio e faltariam exatidão e precisão nas medições subsequentes. Como resultado, seria difícil reproduzir o mesmo conjunto de dados se você realizasse o mesmo experimento novamente.

Este é um problema sério para os pesquisadores que querem publicar seus dados experimentais. Vamos imaginar que um revisor peça que você repita um experimento. Sem uma instrumentação calibrada, você pode ter problemas para obter resultados comparáveis.

Embora haja pouco a ser feito para reduzir as variações biológicas em uma amostra, há modos de monitorar o desempenho do seu microscópio e revelar onde a parcialidade está sendo introduzida em suas imagens e medições. Vamos explorar essas opções mais tarde, após revisarmos os erros e as parcialidades encontradas nas medições quantitativas.

Erros em medições quantitativas

Uma variedade de diferentes análises quantitativas pode ser realizada usando um microscópio. A maioria das aplicações quantitativas inclui medição e comparação de intensidade de fluorescência ou de mudanças espaciais em uma imagem.

Toda medição quantitativa contém alguma quantidade de erro ou parcialidade. Esse erro pode ser introduzido pela amostra ou pelo microscópio e pode se manifestar como inexatidão e/ou imprecisão nas medições. Enquanto a inexatidão produz medições incorretas consistentemente, a imprecisão gera variação em medições repetidas. Ambas são inimigas dos dados reproduzíveis.

Antigamente, muitos estudos de análise de imagem dependiam de medições manuais para a análise quantitativa. Nos últimos vinte anos, vemos uma tendência para a análise de imagens bioinformáticas, bem como ferramentas de software, incluindo programas de IA que podem automatizar medições e aumentar amplamente a produtividade operacional. Por causa disso, a quantidade de dados gerados em experimentos de microscopia quantitativa atingiu novos patamares.

À medida que os pesquisadores produzem cada vez mais imagens por experimento e essas imagens são alimentadas em modelos complexos para serem analisadas e extrair as informações relevantes, é fundamental começar com o conjunto de imagens mais estável e com a maior qualidade possível. Quando a formação de imagem ocorre ao longo de vários dias, durante esse período, um microscópio com desempenho instável certamente apresentará grandes inconsistências nos dados. Não importa o quão poderoso seu software de análise seja, o ground truth nas suas imagens terá o maior efeito na consistência e confiabilidade dos seus dados.

Não é apenas uma maior produtividade operacional e um software de análise que cria as chances de erro. Os sistemas de microscopia atuais são mais complexos do que nunca, com vários componentes ópticos, mecânicos e elétricos. A chance de ocorrer desalinhamento, mau funcionamento ou falha nesses instrumentos aumenta à medida que o número de componentes complexos também aumenta.

Se a complexidade dos sistemas de microscopia aumenta a possibilidade de parcialidades nos seus dados, o que pode ser feito para monitorar o desempenho do microscópio e garantir a consistência nos resultados?

Ferramentas e suporte para monitorar o desempenho do microscópio

Quando você compra um sistema de microscopia pela primeira vez, os principais fabricantes, como a Evident, fornecem um microscópio com parâmetros de desempenho rigorosos e altamente definidos. Durante a instalação, um protocolo preciso é seguido para garantir que o microscópio atenda aos padrões de fábrica.

Com o passar do tempo, algumas métricas de desempenho podem oscilar para fora de um intervalo aceitável e é por isso que uma análise de desempenho do microscópio é tão importante. Você precisa ter certeza de que seu microscópio está funcionando de forma consistente, não importa se for um dia, um mês ou um ano após a compra.

Tradicionalmente, obter informações sobre o desempenho do microscópio tem sido um processo trabalhoso, muitas vezes envolvendo a construção de uma curva de calibração da intensidade de resultados em relação à transmitância percentual com kits de ferramentas de calibração. A resolução de problemas de parâmetros específicos (por exemplo, resolução ou homogeneidade) também era desafiadora antigamente, sendo necessário usar diferentes ferramentas de resolução de problemas para detectar falhas específicas.

Ferramentas integradas de monitoramento de desempenho do microscópio

Atualmente, há soluções mais simples e rápidas que eliminam o trabalho árduo de monitorar o desempenho do microscópio. Considere o seguinte exemplo. Durante a microscopia de intervalo de tempo longitudinal, alguns sistemas de microscópio tem a propensão de ter flutuações no desempenho durante longos intervalos de tempo. Isso produz imagens de intervalo de tempo de qualidade variável.

Uma solução contemporânea, o microscópio confocal de escaneamento a laser FLUOVIEW™ FV3000, tem um poder de laser estável para esses experimentos. Um sistema de controle de monitoramento e feedback da intensidade do laser óptico na unidade de escaneamento fornece intensidade de excitação estável durante estudos de intervalo de tempo prolongado. Isso é demonstrado nas imagens de intervalo de tempo abaixo (Figura 1).

Figura 1. Imagens de intervalo de tempo tiradas com um microscópio confocal FV3000. Linha celular Natural Killer (NK) KHYG-1 (verde) alterando seu formato enquanto ataca e destrói células tumorais HT-29 marcadas com cetuximabe (azul). A absorção de iodeto de propídio (PI) (vermelho) indica morte celular.

Ferramentas externas de monitoramento de desempenho do microscópio

Além das soluções de microscopia integradas para monitoramento de desempenho, há várias soluções externas que podem ajudar usuários e fabricantes de microscópios a garantir que o equipamento de microscopia esteja funcionando de forma ideal. Argolight é uma empresa especializada em soluções de controle de qualidade de microscópios. A empresa projetou uma variedade de lâminas de controle de qualidade e softwares que podem detectar até mesmo pequenas flutuações no desempenho do microscópio.

As soluções de análise de desempenho da Argolight vêm na forma de lâminas ou placas de micropoços. Elas podem ser usadas para controle de qualidade em uma ampla gama de sistemas de microscópio, incluindo microscópios de fluorescência. Essas soluções representam um ponto de partida valioso para pesquisadores que não têm certeza sobre o desempenho dos seus microscópios.

Figura 2. Dois dos 16 padrões fluorescentes estão incorporados em cada lâmina HM da Argolight. Imagem à esquerda: campo do padrão de anéis para inspecionar o nivelamento da imagem. Imagem à direita: padrão de linhas (verticais) espaçadas gradualmente para inspecionar resolução.

Mas como eles funcionam?

Em resumo, as lâminas contêm um traçado fluorescente geométrico altamente definido com uma matriz de pontos focais (exemplos descritos acima na Figura 2). As imagens dessas lâminas são adquiridas e as imagens são analisadas pelo software. O software pode detectar especialmente qualquer parcialidade no desempenho do microscópio e detectar o grau de parcialidade para cada parâmetro. Se algum valor estiver fora do intervalo aceitável determinado pelo usuário, essas informações podem ser enviadas de volta ao fabricante ou à instalação principal na forma de um relatório de erro conciso.

Simplifique a resolução de problemas do seu microscópio para continuar no caminho certo

As soluções rápidas de controle de qualidade do microscópio, como as da Argolight, podem beneficiar tanto o usuário quanto o fabricante. Por exemplo, vamos supor que você detectou um problema no seu microscópio. Enviar um relatório de erro para nossa equipe dedicada de engenheiros de serviço pode ajudá-los na resolução do problema. Com este relatório, eles podem aprimorar rapidamente um componente específico que pode estar com defeito e fazer perguntas mais específicas para ajudar a solucionar o problema.

Em vez de coletar informações de uma mistura de ferramentas analíticas separadas, uma visão geral de todo o desempenho do microscópio em um único relatório pode economizar tempo e dinheiro do usuário. O engenheiro de serviço pode determinar o problema rapidamente para que os usuários possam voltar ao trabalho. Na verdade, uma visão geral detalhada em um relatório resumido aumenta a probabilidade de nossos engenheiros resolverem um problema remotamente, permitindo que os usuários voltem às suas pesquisas com o mínimo de tempo de inatividade do instrumento.

Já vimos muitos de nossos clientes se beneficiarem de instrumentos de resolução de problemas universais que garantem a aquisição de dados confiáveis, removem a parcialidade introduzida pelo microscópio, revelam como o desempenho do sistema evolui com o passar do tempo e os ajudam a obter mais da microscopia quantitativa.

Quer ajuda para solucionar problemas de desempenho do seu microscópio para análise quantitativa? Entre em contato com a nossa equipe dedicada de suporte ao cliente aqui.

Para saber mais sobre as soluções da Argolight, entre em contato com a empresa aqui.

Conteúdo relacionado

Seis dicas para formação de imagem de fluorescência de células vivas

Melhores práticas de câmera para microscópio para formação de imagens de fluorescência

Quantificação sem marcação com a qual você pode contar: um experimento de aprendizagem profunda