Die Dunkelfeldmikroskopie ist ein Verfahren mit Schräglichtbeleuchtung zur Kontrastverstärkung von Proben, die sich unter normalen Beleuchtungsbedingungen nicht optimal darstellen lassen.

Während eine lichtundurchlässige Blende im Kondensor direktes Licht blockiert, wird das Licht, das die Probe im schrägen Winkel passiert, gebeugt, gebrochen und in das Mikroskopobjektiv reflektiert, wo es ein helles Bild der Probe vor einem dunklen Hintergrund erzeugt.

Dieser dunkle Hintergrund ergibt einen hohen Kontrast, wodurch sich Proben mit schwierigem Hintergrund mit vergleichsweise wenig Aufwand deutlich darstellen lassen. Sehen Sie sich auf den folgenden Bildern einige Beispiele an.

Rechts: Spirakel und Tracheen einer Seidenraupenlarve. Winzige Holzsplitter sind überraschend schön, wenn sie unter Dunkelfeldbedingungen mit einem Durchlichtmikroskop betrachtet werden.

Links: Schmetterling. Schmetterlinge gehören wegen der großen Vielfalt an Flügelschuppenmustern bei den Mitgliedern dieser Ordnung zu den farbenprächtigsten Insekten. Das Digitalbild zeigt die vielen Miniaturschuppen, die den Großteil der Oberfläche eines Schmetterlingsflügels bedecken. Die Flügelschuppen wurden mit einem Dunkelfeld-Objekttischkondensor beleuchtet und bei geringer Vergrößerung (50x) aufgenommen.

Wie funktioniert Dunkelfeldmikroskopie?

Dunkelfeldbeleuchtung setzt voraus, dass der Großteil des Lichts, das normalerweise eine Probe innen und außen passiert, blockiert wird, sodass nur schräg einfallende Strahlen auf die Probe treffen.

Die obere Linse eines einfachen Abbé-Dunkelfeldkondensors ist sphärisch konkav, so dass die aus ihrer Oberfläche austretenden Lichtstrahlen einen invertierten hohlen Lichtkegel bilden, dessen Brennpunkt in der Probenebene liegt. An Stellen, wo sich keine Probe befindet und die numerische Apertur des Kondensors größer ist als die des Objektivs, kreuzen sich die Schräglichtstrahlen und verfehlen das Objektiv, sodass die entsprechenden Bereiche dunkel erscheinen.

Die Schräglichtstrahlen treffen auf die auf einen Objektträger aufgebrachte Probe (insbesondere, wenn diese ungefärbt ist und kein Licht absorbiert) und werden von Elementen in der Probe, z. B. der Zellmembran, dem Zellkern und inneren Organellen, gebeugt, reflektiert und/oder gebrochen. Auf diese Weise gelangen diese schwachen Strahlen ins Objektiv. Das Ergebnis ist eine helle Probe vor einem schwarzen Hintergrund.

Welche Komponenten werden für die Dunkelfeldmikroskopie benötigt?

Fast jedes Hellfeld-Labormikroskop lässt sich problemlos für die Dunkelfeldbeleuchtung umrüsten. Am einfachsten ist es, den vorhandenen Kondensor gegen einen Kondensor auszutauschen, der für Dunkelfeldbeleuchtung ausgelegt ist (Abbildung 1).

Diese Kondensoren sind vergleichsweise einfach aufgebaut und weisen die hohe numerische Apertur (NA) auf, die erforderlich ist, um den für die Dunkelfeldmikroskopie erforderlichen Beleuchtungskegel zu erzeugen. Allerdings ist der Austausch von Kondensoren je nach Beleuchtungsart bei einem im Arbeitsalltag ständig verwendeten Mikroskop recht unpraktisch. Glücklicherweise gibt es eine Lösung.

Viele Kondensoren können Einsätze aufnehmen, mit denen sich ein Beleuchtungskegel erzeugen lässt. Diese Einsätze bieten keine so hohe NA wie ein spezialisierter Dunkelfeldkondensor, weshalb nicht alle Objektive verwendet werden können. Andererseits ermöglichen die Einsätze die flexible Anwendung mehrerer Mikroskopieverfahren mit demselben Kondensor.

Abbildung 1: Für die Dunkelfeldbeleuchtung ausgelegter Kondensor

Weshalb ist die Dunkelfeldmikroskopie eine nützliche Bildgebungstechnik?

Objekte, die unter den richtigen Bedingungen mit Dunkelfeldbeleuchtung aufgenommen werden, bieten meist einen spektakulären Anblick. Proben, die bei der Hellfeldmikroskopie wenig eigenen Kontrast aufweisen, stellen sich unter Dunkelfeldbeleuchtung häufig hell strahlend dar.

Die Dunkelfeldbeleuchtung ist insbesondere optimal für die Darstellung von Umrissen, Rändern, Grenzen und Brechungsindexgradienten. Ideale Kandidaten für die Dunkelfeldmikroskopie sind unter anderem im Wasser lebende Kleinstorganismen, Diatomeen, winzige Insekten, Knochen, Fasern, Haare, ungefärbte Bakterien, Hefen, Zellen in Gewebekulturen und Protozoen.

Geeignete nicht-biologische Proben sind beispielsweise Mineralien und chemische Kristalle, Kolloidpartikel, Staubmessproben und Dünnschnitte von Polymeren und Keramiken, die kleine Einschlüsse, Porositätsunterschiede oder Brechungsindexgradienten aufweisen.

Hier sind einige Beispiele von Proben, die mittels Dunkelfeldbildgebung aufgenommen wurden:

Links: Dieses spektakuläre Dunkelfeldmikroskopiebild der Kieselalge Arachnoidiscus ehrenbergi wurde von Mortimer Abramowitz mit einem Olympus Mikroskop aufgenommen. Die Probe wurde mit einem Dunkelfeldkondensor mit hoher numerischer Apertur und Immersionsöl zwischen dem Objektträger und dem Objektiv und der Kondensorfrontlinse aufgenommen. Mitte: Lindenholz. Gefärbte Proben sind häufig ideale Kandidaten für die Dunkelfeldmikroskopie und liefern ästhetische, farbige Bilder vor einem dunklen Hintergrund. Diese Mikrophotographie zeigt einen gefärbten Dünnschnitt von Lindenholz bei Dunkelfeldbeleuchtung. Rechts: Flüssigkristalline DNA. Die hochkonzentrierte DNA-Lösung durchlief eine Reihe von flüssigkristallinen Phasenübergängen, bevor sie eine dichtgepackte hexagonale Phase ausbildete. Diese Mikrophotographie wurde mit einem optischen Verbundmikroskop mit 10x Objektiv unter Dunkelfeldbeleuchtung aufgenommen.

Leider ist die Dunkelfeldbeleuchtung weniger geeignet für die Darstellung innerer Details. Darüber hinaus müssen, um die Dunkelfeldbeleuchtung optimal zu nutzen, weitere Voraussetzungen berücksichtigt werden.

Was sind die Herausforderungen beim Einsatz der Dunkelfeldmikroskopie?

Bei der Vorbereitung von Proben für die Dunkelfeldmikroskopie ist Vorsicht erforderlich, da die Strukturen oberhalb und unterhalb der Fokusebene Licht streuen und das Bild verschlechtern können. Die Sauberkeit eines Objektträgers ist ein wesentlicher Faktor bei der Bildgebung. Bei der Dunkelfeldmikroskopie ist sie sogar noch wichtiger, da im Dunkelfeld jedes Schmutzteilchen beleuchtet wird und von den relevanten Details ablenken kann.

Weitere Herausforderungen bei der Einrichtung eines Mikroskops für die Dunkelfeldmikroskopie sind unter anderem:

• Für die Darstellung der Probe unzureichende Beleuchtung, oder die Probe ist nur sehr schwach sichtbar.

  Um bei der Dunkelfeldmikroskopie eine deutliche Darstellung zu erzielen, ist viel Licht erforderlich, da bei der Bildung des Kegels ein hoher Anteil blockiert wird. Zögern Sie daher nicht, die Beleuchtung zu verstärken, seien Sie sich aber bewusst, dass einige Proben eine höhere Lichtmenge auf Dauer möglicherweise nicht tolerieren.

• In der Mitte des Sehfeldes befindet sich ein dunkler Fleck, die Objekte am Rand sind jedoch gut beleuchtet und erscheinen normal.

  Die Ursache hierfür ist in der Regel ein falsch ausgerichteter oder mangelhaft fokussierter Kondensor. Durch Zentrieren und Scharfeinstellung des Kondensors lässt sich dieses Problem beseitigen. Diese Lösung ist auf die meisten Situationen anwendbar, in denen die Beleuchtung uneben erscheint, die Probe aber scharfgestellt ist.

• Im Hintergrund erscheinen Farben, oder der Hintergrund ist ungleichmäßig beleuchtet und zeigt einen Grauschleier.

  Dies ist häufig die Folge, wenn die Probe zu dick ist oder in kontaminiertem Medium aufgebracht wurde. Erneutes Aufbringen der Probe sollte Abhilfe schaffen.

Welches sind die Vorteile der Dunkelfeldmikroskopie?

Die Dunkelfeldmikroskopie bietet viele Vorteile. Der dunkle Hintergrund ermöglicht ein hohes Maß an Kontrast, der die Darstellung von Proben vor einem schwierigen Hintergrund erleichtert. Diese Technik ist einfach zugänglich, da viele Labormikroskope mit Hellfeldfunktion für Dunkelfeldbeleuchtung konfiguriert werden können. Abgesehen von ihren Vorteilen für die Mikroskopie können Dunkelfeldbilder wunderschön ausgeleuchteter Proben sogar wie Kunstwerke aussehen.

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