Desarrollo de una nueva aplicación Fucci (CA): Sonda fluorescente para visualizar ciclos celulares
Fucci (indicador de ciclo celular basado en la ubiquitinzación fluorescente) es un grupo codificado genéticamente de dos sensores fluorescentes para monitorización del ciclo celular en tiempo real. Fucci (CA), creado en 2017, marca el núcleo con mCherry (rojo) o mVenus (azul) siguiendo un patrón que depende del ciclo celular. Fucci (CA) proporciona una expresión abundante de mCherry durante la fase G1 con una reducción acusada en la fluorescencia roja al final de la fase G1. Fucci (CA) puede usarse para detectar con fiabilidad una fase G1 corta y distinguir las fases S y G2, lo que anteriormente era difícil de conseguir.
Fucci (SA) |
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Fucci (CA) |
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Figura 1: Visualización de la progresión del ciclo celular mediante Fucci (SA) y Fucci (CA)
Adquisición de imágenes de intervalo de tiempo de baja fototoxicidad de células ES no diferenciadas
Las células madre embrionarias (ES) no diferenciadas proliferan rápidamente y son muy delicadas. La fototoxicidad durante el procesamiento de imágenes de intervalo de tiempo puede dañar las células ES y reducir su velocidad de proliferación, haciendo que sea complicado procesar imágenes de intervalo de tiempo de células ES bajo condiciones precisas a nivel fisiológico. El microscopio FV3000 permite procesar imágenes de intervalo de tiempo de baja toxicidad usando una potencia del láser extremadamente baja gracias a la trayectoria súper eficiente y los dispositivos de detección sensibles. Estas propiedades del FV3000 permitió a un grupo de investigación llevar a cabo un experimento de intervalo de tiempo de 57 horas de duración, en el cual se cubrieron tres ciclos celulares normales de células de ES no diferenciadas con una división rápida en su totalidad.
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Figura 2: Observación de intervalo de tiempo de células ES de ratón marcadas con Fucci (CA) 2.1
Condiciones de procesamiento de imágenes
Muestra: células ES de ratón
Objetivo: objetivo de inmersión en silicona (UPLSAPO30XS)
Microscopio: sistema FLUOVIEW FV3000
Láser: 445 nm (AmCyan), 594 nm (mCherry)
Detección de fase corta G1
Fucci (CA) marca completamente la fase G1 con una señal roja intensa, que permite realizar una medición precisa de los límites de fase, incluso en células de ES no diferenciadas de rápida proliferación. Usando la observación de intervalo de tiempo a nivel celular único, pudimos observar que las células ES de ratón (mESCs) proliferaban con el doble de tiempo (11 horas) y una fase G1 de tan solo una hora.
Figura 3: Perfiles temporales de intensidades fluorescentes (F.I.) de un núcleo celular único expresando Fucci (CA) 2.1
Características de FV3000 usadas en este experimento
Sistema completamente espectral que proporciona una alta sensibilidad
La serie FV3000 emplea la tecnología TruSpectral de Olympus que difracta la luz por medio de la transmisión a través de la unidad de holograma de fase de volumen. Esta tecnología proporciona una emisión de luz mucho mayor que el de las unidades de detección espectral convencionales con rejillas de tipo reflexión.
Óptima relación entre señal y ruido con luz de baja excitación
La unidad detectora de alta sensibilidad del FV3000 tiene hasta cuatro canales de tubos fotomultiplicadores GaAsP (PMT) que capturan las señales fluorescentes débiles con una eficacia cuántica máxima del 45 %. Además, la refrigeración por efecto Peltier en estos detectores reduce el ruido de fondo en un 20%. Conjuntamente, estas características permiten procesar imágenes con una relación alta entre señal y ruido, incluso con luz de baja excitación.
Adquiera imágenes de ciclo celular precisas a nivel fisiológico: Comentario del Dr. Asako Sakaue-Sawano
Las mESCs no diferenciadas se dividen y se mueven en un espacio tridimensional (3D) de cultivo celular, que requiere el procesamiento de imágenes XYZT para controlar su proliferación. Durante el procesamiento de imágenes de intervalo de tiempo, el escaneo láser repetido puede inducir potencialmente a alteraciones del ciclo celular en mESC no diferenciados debido a su alta susceptibilidad a la fototoxicidad. El microscopio FV3000 ha permitido al Dr. Asako Sakaue-Sawano y sus compañeros llevar a cabo experimentos de procesamiento de imágenes en 4 dimensiones (XYZT) para caracterizar de forma precisa todo el ciclo celular con una fase G1 muy corta de células ES de ratón de rápida proliferación a nivel celular único.
Reconocimientos
Esta nota de aplicación has sido preparada con la ayuda de los siguientes investigadores.
Laboratorio de Dinámica de Funciones Celulares, Instituto de Ciencias del Cerebro RIKEN
Dr. Masahiro Yo |
Dr. Asako Sakaue-Sawano |
Dr. Atsushi Miyawaki |
Referencias:
Para obtener más información sobre los estudios mencionados en esta nota de aplicación, consulte el artículo siguiente:
A. Sakaue-Sawano, et al. «Genetically Encoded Tools for Optical Dissection of the Mammalian Cell Cycle». Molecular Cell, volume 68, issue 3 (October 2017): pp. 626–640.e5.
Productos usados para esta aplicación
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