Usando a microscopia multifotônica intravital para visualizar interações dinâmicas entre neutrófilos e monócitos/macrófagos em uma via aérea de camundongo infectado com influenza

O sistema imunológico inato do corpo é a primeira linha de defesa contra a infecção viral. Uma de suas principais funções é o recrutamento de vários tipos de glóbulos brancos, ou leucócitos, para os locais de infecção (por exemplo, as vias aéreas). Todos esses leucócitos, incluindo neutrófilos e monócitos/macrófagos, agem em coordenação para construir a defesa do corpo contra o vírus. Obter uma compreensão mais profunda dos mecanismos desse processo imunológico inato ajudará os pesquisadores a desenvolver e melhorar a eficácia de vacinas e terapias.

Nesta nota de aplicação, Dr. Minsoo Kim e seus colegas examinaram a dinâmica de neutrófilos e monócitos/macrófagos in vivo em uma traqueia de camundongo infectado com influenza usando microscopia multifotônica intravital. A observação 3D e a análise de imagens revelaram padrões de motilidade não reconhecidos anteriormente de interações entre neutrófilos e monócitos/macrófagos.

A reconstrução 3D de imagens mostra a migração de neutrófilos na traqueia de camundongos infectados com influenza. Vermelho, neutrófilo; branco, vaso sanguíneo. Barra de escala, 50 μm. A fluorescência do tdTomato foi excitada em 975 nm e detectada no canal vermelho (575–630 nm). A fluorescência Alexa Fluor 647 foi excitada em 1.200 nm e detectada no canal vermelho distante (645-685 nm). (Dados adaptados da Referência [1])

Migração de neutrófilos na traqueia de camundongo infectado com influenza

Para visualizar os neutrófilos na traqueia de camundongos infectados com influenza, camundongos Ly6G-Cre/ROSA-tdTomato foram infectados com o vírus da gripe. Dentro de 3-6 dias após a infecção, houve uma infiltração transitória maciça de neutrófilos e monócitos na traqueia. Para marcar os vasos sanguíneos, o anticorpo CD31 conjugado com Alexa Fluor 647 foi injetado IV nos camundongos antes da imagem. A microscopia multifotônica intravital foi realizada na traqueia canulada cirurgicamente de camundongos anestesiados. Conforme mostrado no Vídeo 1, ambos os neutrófilos tdTomato (vermelho) e vasos sanguíneos (branco) foram visualizados, mostrando a migração de neutrófilos em torno dos vasos sanguíneos vizinhos na traqueia de camundongos infectados com influenza.

Padrões de motilidade de interações entre neutrófilos e monócitos/macrófagos

Para visualizar neutrófilos e monócitos/macrófagos na traqueia de camundongos infectados com influenza, camundongos Ly6G-Cre/ROSA-tdTomato/Csf1r-EGFP foram infectados com o vírus da influenza. Os neutrófilos expressaram GFP e tdTomato (mostrando fluorescência vermelha/laranja), enquanto monócitos/macrófagos expressaram apenas GFP (mostrando fluorescência verde). Conforme mostrado no Vídeo 2, neutrófilos GFP/tdTomato (vermelho/laranja), monócitos/macrófagos GFP (verde) e vasos sanguíneos (branco) foram visualizados na traqueia de camundongo infectado por influenza. No quinto dia após a infecção, a maioria dos monócitos/macrófagos tornou-se imóvel, enquanto a maioria dos neutrófilos permaneceu altamente móvel e constantemente se moveu em estreita proximidade com os monócitos/macrófagos circundantes.

Migração e interações de neutrófilos e monócitos/macrófagos na traqueia de camundongos infectados com influenza. Vermelho/laranja, neutrófilo; verde, monócitos/macrófagos; branco, vaso sanguíneo. Barra de escalas: 50 μm Ambas as fluorescências GFP e tdTomato foram excitadas em 975 nm e então detectadas no canal verde (495–540 nm) e no canal vermelho (575–630 nm), respectivamente. A fluorescência Alexa Fluor 647 foi excitada em 1.200 nm e detectada no canal vermelho distante (645-685 nm). (Dados adaptados da Referência [1])

Um olhar mais atento em uma ampliação maior revelou mais detalhes no padrão de interação entre neutrófilos e monócitos/macrófagos. O vídeo 3 mostra a reconstrução 3D da migração de neutrófilos entre os monócitos/macrófagos na traqueia do camundongo durante o sexto dia após a infecção. Este vídeo mostra que neutrófilos altamente móveis (vermelho) se encontraram ativamente e se moveram para monócitos/macrófagos circundantes não migratórios (verde). Os encontros frequentes levaram ao envolvimento de neutrófilos por monócitos/macrófagos, indicando o mecanismo de remoção dos neutrófilos agonizantes da traqueia infectada.

A reconstrução 3D de imagens mostra interações detalhadas entre neutrófilos e monócitos/macrófagos na traqueia de camundongo infectado com influenza (dia 6 pós-infecção). Vermelho, neutrófilo; verde, monócitos/macrófagos. Ambas as fluorescências GFP e tdTomato foram excitadas em 975 nm e então detectadas no canal verde (495–540 nm) e no canal vermelho (575–630 nm), respectivamente. (Dados adaptados da Referência [1])

Como o microscópio multifotônico FVMPE-RS facilitou nosso experimento

Sistema FVMPE-RS Twin-Laser para imagens simultâneas de múltiplos fótons de comprimento de onda

O microscópio multifotônico FVMPE-RS oferece suporte a dois laseres de excitação multifotônicos independentes para imagens multifotônicas simultâneas de vários comprimentos de onda. Os comprimentos de onda de excitação ideais podem ser usados ao mesmo tempo para cada fluoróforo sem ter que ajustar repetidamente o laser. O controle de potência independente de cada laser permite a aquisição de imagens balanceadas de diferentes fluoróforos.

Estrutura Gantry do sistema de microscópio para imagens de camundongos in vivo

A estrutura gantry oferece um alto grau de flexibilidade para se adequar a diferentes amostras. O grande espaço de amostra sob o microscópio (640 × 520 × 350 mm) é ideal para imagens in vivo/intravital de pequenos animais, bem como acomodar configurações caseiras para esses experimentos.

Objetiva dedicada de excitação multifóton XLPLN25XWMP2

Objetivas dedicadas à excitação multifotônica são otimizadas para imagens multifotônicas profundas no tecido. O revestimento óptico oferece boa transmissão de 400 nm a 1.600 nm para garantir excitação no infravermelho próximo eficiente e coleta de fluorescência visível. A objetiva XLPLN25XWMP2 de imersão em água da Olympus tem uma alta abertura numérica (NA 1.05), longa distância de trabalho (2,0 mm) e amplo campo de visão (FN 18 mm), que fornecem excelente desempenho para imagens multifotônicas in vivo/intravital.

Biografia do Dr. Minsoo Kim

Dr. Minsoo Kim é Professor Reitor de Microbiologia e Imunologia e Diretor do Programa de Pesquisa de Imunoterapia de Tumor no Instituto do Câncer Wilmot, e membro do David H. Smith Center for Vaccine Biology and Immunology. Seus interesses de pesquisa estão na área de respostas imunes inatas e adaptativas e imunoterapia contra o câncer. Ele é especialmente conhecido por suas contribuições pioneiras para o desenvolvimento das técnicas de imagem mais avançadas que permitem a observação em tempo real e o controle de respostas imunes dinâmicas em células vivas e modelos animais vivos.

Agradecimentos

Esta nota de aplicação foi preparada com a colaboração dos Drs. Minsoo Kim e Kihong Lim do Departamento de Microbiologia e Imunologia, David H. Smith Center for Vaccine Biology and Immunology, University of Rochester, NY, EUA.

Referência

[1] Kihong Lim, Tae-hyoun Kim, Alissa Trzeciak, Andrea Amitrano, Emma Reilly, Hen Prizant, Deborah Fowell, David Topham e Minsoo Kim. A efferocitose neutrofílica in situ molda a imunidade das células T à infecção por influenza. Nature Immunology 21, 1046–1057 (2020).