Konfokale Laserscanning-Mikroskope sind beliebte Tools in der biologischen Forschung. Sie werden in der Regel eingesetzt, um bei guter Farbtrennung mehrere Fluorophore gleichzeitig abzubilden und Strukturen tief im Innern einer biologischen Probe mit erweiterten Schnittdarstellungsmöglichkeiten darzustellen.

Heute können die jüngsten lasertechnischen Innovationen Anwendungen wie diesen zugutekommen und ausgeklügeltere Experimente ermöglichen. In diesem Blogartikel diskutieren wir, wie die neuen Nahinfrarotlicht- (NIR)-Anregungslaser zusammen mit unseren FV3000 Konfokalmikroskopen hochmoderne Multiplexing-Anwendungen möglich machen.*

Hindernisse für das Multiplexing mit mehr als 5 Kanälen bei der Konfokalmikroskopie und wie man sie überwindet

Werfen wir zunächst einen Blick auf die Geschichte der Multiplexing-Experimente.

Jahrelang führten viele Wissenschaftler Immunfluoreszenzuntersuchungen mit DAPI und zwei anderen Farben durch, in der Regel im grünen und roten Bereich des Spektrums.

Durch die Weiterentwicklung der Antikörper einerseits und der Imaging-Systeme andererseits, die nun mit mehr Detektoren und besseren Wellenlängenfiltern ausgestattet waren, wurde die Vierfarben-Immunfluoreszenz populär. DAPI und Farben im grünen, roten und fernroten Spektralbereich bildeten die häufigste Vierfarbenkombination.

Zwei wichtige Faktoren stellten jedoch Hindernisse für die Einführung eines fünften Kanals für das Multiplexing dar.

1. Der Mangel an NIR-Laserdioden mit guten Strahlqualitäten.

Erstens waren NIR-Laserdioden mit guten Strahlqualitäten für konfokale Laserscanning-Mikroskope nicht allgemein verfügbar. Notwendige Merkmale von Laserdioden zur Anwendung in der konfokalen Bildgebung sind eine ausreichende (aber nicht zu hohe) Leistung, sehr geringe Leistungsschwankungen und kompatible Strahlprofile. Bis vor einigen Jahren waren allerdings nur wenige Optionen für NIS-Laserdioden in diesen Wellenlängenbereichen verfügbar.

Dank der jüngsten Laserdiodentechnologie hat sich das jedoch geändert. Unser FV3000 Konfokalmikroskop bietet nun 730-nm- und 785-nm-Laserdioden zur effizienten Anregung von Sekundärfarbstoffen wie:

• Cyanine7 (Cy7)
• Alexa Fluor 750
• Alexa Fluor 790
• DyLight 800
• IRDye 800
• Indocyaningrün (ICG)

Diese Farbstoffe, zusammen mit einer wachsenden Anzahl neuer Fluorophore, machen das Hinzufügen eines fünften und sechsten simultanen Kanals für das Multiplexing attraktiver.

2. Photomultiplier-Röhren mit reduzierter Empfindlichkeit im NIR-Wellenlängenbereich.

Ein zweites Hindernis bestand darin, dass viele Photomultiplier-Röhren (PMT) bei den für Anregung bei 730 nm und 785 nm typischen Detektionswellenlängen eine reduzierte Empfindlichkeit aufweisen.

Diese reduzierte Empfindlichkeit in den Nahinfrarotlicht-Detektionsbereichen betrifft vor allem populäre GaAs-PMT, die andererseits aber höhere Empfindlichkeit im mittleren sichtbaren Spektrum bieten. Im Bereich ab 750 nm haben GaAsP-Detektoren eine sehr geringe Empfindlichkeit.

Um dieser Herausforderung zu begegnen, integrierten wir rotverschobene GaAs-Detektoren in unser FV3000 Laser-Konfokalmikroskop.

Unser FV3000-System ist nun mit GaAs-Detektoren in vielen unterschiedlichen Kombinationen mit Multialkali- (Standard) und GaAsP-PMTs (hohe Empfindlichkeit) ausgestattet. Bei diesen Konfigurationen können GaAs-Detektoren als fünfter oder sechster Kanal^* für Multiplexing-Anwendungen eingesetzt werden. (^*Es gelten einige Einschränkungen)

In Kombination mit unseren X Line-Hochleistungsobjektiven ermöglicht unser FV3000-System eine hochwirksame und breite Korrektur der chromatischen Aberration zwischen 400 und 1000 nm. Dies führt zu einer deutlich besseren Farbwiedergabe beim Hellfeld- und Fluoreszenz-Imaging.

^*Hierbei handelt es sich um eine benutzerspezifische Lösung, die möglicherweise in einigen Regionen nicht erhältlich ist. Kontaktieren Sie bitte den Olympus Händler in Ihrer Nähe, um detaillierte Informationen zu erhalten.

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