共焦点レーザー走査型顕微鏡は、最近では生物学研究ツールとしてそれほど珍しいものではなくなってきたと言えるでしょう。このツールは、良好な色分解で複数蛍光の同時イメージングに、また、強化したセクショニング効果で標本内の深部のイメージングに使用します。
今日、最新のレーザー技術改革は、これらのアプリケーションにとって有用であり、より高度な実験が可能となります。今回の投稿では、オリンパスのFLUOVIEW FV3000共焦点顕微鏡の新近赤外線（NIR）励起レーザーが高度多重化アプリケーションをどのように推進しているかを解説します。*
共焦点顕微鏡法における5チャンネル以上の多重蛍光イメージングの障害とその克服方法
まず、多重蛍光イメージングの歴史に焦点を合わせることから始めましょう。
多くの研究者は長年、DAPIと他の2色（通常、緑と赤のスペクトル内）で蛍光イメージングに取り組んできました。
より多くの検出器やより優れた蛍光波長フィルタリングによる抗体とイメージングシステムの進化に伴い、4色の免疫蛍光が主流となりましたが、DAPI、緑、赤および遠赤の色は、最も一般的な4色の組み合わせでした。
しかし、2つの重要な要素が多重蛍光イメージングにおける5つ目のチャンネル導入の障害となっていました。
1. 優れた光線品質のNIRレーザーダイオードの欠落
第一に、共焦点レーザー走査型顕微鏡のための優れた光線品質のNIRレーザーダイオードは広く流通していませんでした。十分な（しかし過度ではない）強度、最小限の強度変動および対応する光線プロファイルは全て、共焦点イメージングで使用するレーザーダイオードの不可欠な特徴です。しかしNIRレーザーダイオードの選択肢は、これらの波長領域において、数年前までほとんどありませんでした。
ところが、これが最新のレーザーダイオード技術によって一変したのです。オリンパスのFV3000共焦点顕微鏡は、新たに730nmおよび785nmのレーザーダイオードに対応しているので、次のような2次色素が効率的に励起できます。
- Cyanine7 (Cy7)
- Alexa Fluor 750
- Alexa Fluor 790
- DyLight 800
- IRDye 800
- インドシアニン・グリーン（ICG）
ますます増加する新たな蛍光と共に、これらの染料は多重蛍光イメージングの5つ目、6つ目の同時チャンネルの追加をより魅力的なものにしています。
2. NIR波長で感度が低減するフォトマルチプライアーチューブ
2つ目の障害は、多くのフォトマルチプライアーチューブ（PMT）において、730～785nmの励起の一般的な検出領域で感度が下がっていたことです。
近赤外域におけるこの感度の低減は、可視スペクトルの中心で感度が上がる、GaAsP PMTで特に発生していました。また、750nm以上の領域では、GaAsディテクターの感度はほとんどありませんでした。
この問題を解決するために、オリンパスではFV3000共焦点レーザー顕微鏡に赤方変移GaAsディテクターを組み込みました。
オリンパスのFV3000は新たに、マルチアルカリ（スタンダード）PMTおよびGaAsP（高感度）PMTとの様々な組み合わせでGaAsディテクターを提供しています。これらの設定では、多重蛍光イメージングの5つ目または6つ目の検出チャンネル*としてGaAsPディテクターが利用できます。（*一定の制限が適用されます）
さらに、オリンパスのX Line高性能対物レンズと組み合わせると、FV3000システムにおいて、高品質な400～1000の幅広い色収差補正が可能になります。これにより、明視野およびマルチカラー蛍光イメージングで、さらに優れた色再現性が実現します。
*これはカスタマイズしたソリューションであり、地域により販売状況が異なる場合があります。詳細については、最寄りのオリンパス代理店までお問い合わせください。
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