Os microscópios confocais de varredura a laser são ferramentas de pesquisa biológica populares. Eles são geralmente usados para adquirir imagens imediatas de diversos fluoróforos com boa separação de cor, bem como para adquirir imagens dentro de um espécime biológico com capacidades de segmentação aprimoradas.
Atualmente, as mais recentes inovações em tecnologia de laser podem beneficiar de aplicações como estas e propiciar experimentos mais avançados. Nesta postagem do blog, discutiremos sobre como os novos lasers de excitação de infravermelho próximo (NIR) nos nossos microscópios confocais FV3000 estão impulsionando aplicações de multiplexagem avançadas.*
Obstáculos à multiplexagem com mais de 5 canais em microscopia confocal e como superá-los
Vamos começar por esclarecer a história dos experimentos de multiplexagem.
Durante anos, muitos pesquisadores realizaram imunofluorescência com DAPI e duas outras cores, geralmente nos espectros verde e vermelho.
Com o avanço dos anticorpos e dos sistemas de formação de imagem através de mais detectores e melhor filtragem do comprimento de onda da emissão, a imunofluorescência de quatro cores se tornou popular. As cores DAPI, verde, vermelho e vermelho distante eram a combinação de cores mais comum.
Contudo, dois fatores críticos criaram obstáculos à introdução de um quinto canal para multiplexagem.
1. A falta de díodos laser NIR com boas qualidades de feixe.
Primeiro, díodos laser NIR com boas qualidades de feixe para microscópios de varredura confocal a laser não estavam amplamente disponíveis. Energia adequada (mas não excessiva), baixas flutuações de energia e perfis de feixe compatíveis são recursos necessários para díodos laser usados na formação de imagens confocais. Contudo, somente algumas opções de díodo laser NIR estavam disponíveis nestes intervalos de comprimento de onda até há poucos anos.
Mas tudo isso mudou graças à mais recente tecnologia de díodo laser. O nosso microscópio confocal FV3000 agora oferece díodos laser de 730 nm e 785 nm para uma excitação eficiente de corantes secundários, como:
- Cyanine7 (Cy7)
- Alexa Fluor 750
- Alexa Fluor 790
- DyLight 800
- IRDye 800
- Verde de indocianina (ICG)
Estes corantes, junto com um número crescente de novos fluoróforos, estão tornando mais apelativa a adição de um quinto e sexto canal simultâneo para multiplexagem.
2. Tubos fotomultiplicadores com sensibilidade reduzida em comprimentos de onda NIR.
Um segundo obstáculo é o fato de que muitos tubos fotomultiplicadores (PMTs) possuem sensibilidade reduzida na detecção de comprimentos de onda típicos para uma excitação de 730 nm e 785 nm.
Esta sensibilidade reduzida nos intervalos de detecção de infravermelho próximo é especialmente verdadeira para PMTs GaAsP populares que oferecem maior sensibilidade no meio do espectro visível. Os detectores de GaAsP possuem pouquíssima sensibilidade no intervalo acima de 750 nm.
Para superar este desafio, nós integramos detectores de GaAs desviados para o vermelho nos nossos microscópios confocais a laser FV3000.
Agora, o nosso sistema FV3000 oferece detectores de GaAs em diversas combinações diferentes com PMTs multialcalinos (padrão) e PMTs GaAsP (alta sensibilidade). Estas configurações podem usar detectores de GaAs como o quinto ou sexto canal* para aplicações de multiplexagem. (*Algumas limitações se aplicam)
Em combinação com as nossas objetivas de alto desempenho da X Line, os nossos sistemas FV3000 podem fornecer ampla correção de aberração cromática de alta qualidade entre 400–1.000 nm. Isso resulta em uma reprodutibilidade de cor muito melhor durante a formação de imagens de fluorescência multicores e de campo claro.
*Esta é uma solução personalizada e pode não estar disponível em algumas regiões. Entre em contato com o seu representante local da Olympus para obter informações detalhadas.
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