Objetivas para microscópio confocal

Para qualquer configuração convencional de microscópio óptico, a objetiva é o componente mais crucial do sistema para determinar o conteúdo de informação da imagem. O contraste e a resolução de detalhes sutis de um espécime, a profundidade até a qual é possível obter informações em um espécime e a extensão lateral do campo de imagem são elementos determinados pelo desenho da objetiva e seu desempenho sob as condições específicas usadas para a observação. Em técnicas confocais de escaneamento, a objetiva recebe demandas adicionais, pois esse componente crucial de formação de imagem também atua como um condensador de iluminação e, muitas vezes, precisa apresentar alta precisão em uma grande variedade de comprimentos de onda e com níveis muito baixos de iluminação sem a introdução de ruído inaceitável que degrade a imagem.

Independentemente da função de qualquer outro componente do sistema, não é possível adicionar nenhuma informação a uma imagem que não tenha sido inicialmente capturada pela objetiva. Alguns componentes intermediários na trajetória da formação de imagem podem realizar funções de correção, porém, o requisito primário de desempenho para esses elementos é que eles exerçam o mínimo de degradação das informações básicas de imagem recebidas da objetiva. Tradicionalmente, as principais variáveis consideradas na seleção de uma objetiva para uma aplicação específica são o aumento, se a aplicação requer um desenho seco ou de imersão, além da abertura numérica do sistema de lente. Além dos aprimoramentos ópticos contínuos promovidos por fabricantes de microscópios, o desenvolvimento de novas técnicas de formação de imagem promovidas por avanços tecnológicos em lasers, corantes fluorescentes e novas capacidades de marcação de espécime impulsionaram drasticamente o progresso em determinadas áreas de pesquisa. Isso é particularmente verdadeiro nos campos de neurociência e biologia celular e molecular, e o microscópio confocal combinado com técnicas de fluorescência passou a ser altamente requisitado como uma ferramenta de pesquisa.

A Figura 1 apresenta uma objetiva de alto desempenho especificamente desenvolvida para uso com iluminação a laser nas regiões entre violeta ao infravermelho próximo do espectro. A objetiva é um modelo 60X apocromático de imersão em óleo com campo plano, corrigida para os comprimentos de onda entre 405 e 1.000 nanômetros. Entre as aplicações úteis dessa objetiva, podemos citar observações de fluorescência simultânea e contraste de interferência diferencial (Differential interference contrast, DIC).

Embora os requisitos altamente dinâmicos impostos por novas técnicas tenham tornado praticamente corriqueira a aproximação dos limites de desempenho desses sistemas de lentes, as demandas gerais exigidas de uma objetiva em instrumentos confocais são semelhantes às demandas em outras aplicações cruciais de microscopia. As limitações específicas de determinadas aplicações deixaram claro que outras características da objetiva podem ser igualmente importantes (ou até mais importantes) em relação às que sempre foram consideradas prioritárias. Para satisfazer requisitos essenciais de técnicas atualmente promissoras, os fabricantes lançaram novas ópticas especificamente voltadas para a otimização do desempenho desses métodos. O desenvolvimento de objetivas altamente corrigidas, com alta abertura numérica e imersão em óleo de silicone é um exemplo da resposta ao aumento drástico em pesquisas nas áreas de tecido e células vivas, obrigatoriamente conduzidas em meio aquoso. É possível que os requisitos específicos na microscopia confocal leve ao desenvolvimento de óptica com correção mais rigorosa de uma ou mais aberrações que comprometam a resolução, mas favorecendo a concretização de outras metas de desenhos que sejam mais cruciais ao desempenho confocal.

Resolução de microscópio de varredura a laser

Normalmente, a resolução em sistemas ópticos é tida como a distância mínima de separação entre duas características de um espécime que permita a diferenciação delas como dois elementos distintos na imagem final. Definida com base em um contraste específico necessário para o reconhecimento visual, é possível quantificar a resolução como uma função do comprimento de onda da luz (λ) e da abertura numérica (AN) do sistema óptico. Qualquer interferência entre frentes de onda difratadas por meio da abertura da lente produz a distribuição de intensidade do disco de Airy no plano de imagem, cujo diâmetro (d) é indicado pela seguinte equação, no sistema ideal limitado por difração:

d_Airy= 1,22 • λ/AN

O notório critério de Rayleigh considera dois pontos idênticos como meramente passíveis de discernimento quando separados pela metade do diâmetro do disco de Airy. Consequentemente, o raio de Airy (r) é equivalente à resolução lateral, sendo definido pela modificação da equação anterior. Mediante o uso de epifluorescência, a objetiva funciona como condensador e objetiva. Por isso, AN representa a abertura numérica da objetiva na expressão a seguir:

r_Airy= 1,22 • λ/(2 • AN)

As limitações de difração que resultam em redistribuição lateral de intensidade de objetos de ponto e os transformam em padrões de Airy também produzem desfocagem por toda a extensão do eixo óptico, alterando o tamanho e a forma do ponto de imagem. A função de intensidade tridimensional de dispersão de pontos descreve a distribuição de intensidade e representa o desempenho do sistema óptico na transferência de informações do espécime para o plano de imagem. Várias aberrações ópticas são características de sistemas de lentes refrativas e qualquer uma delas que não seja corrigida pelo desenho da objetiva ou compensada por outro componente óptico vai alterar a distribuição de intensidade que representa cada ponto do espécime na imagem, degradando a imagem em relação ao desempenho ideal limitado por difração. Ao escolher as objetivas para a técnicas, é necessário levar em consideração essa importância relativa das possíveis aberrações em aplicações confocais. Nas próximas seções, discutiremos os principais fatores no desenho e no desempenho da objetiva, especificamente em relação ao microscópio confocal.

A configuração de microscópio confocal mais usada em aplicações biológicas emprega um sistema de escaneamento computadorizado para desviar um feixe laser de iluminação (focalizado por meio da objetiva) sobre um espécime estacionário. Essa metodologia é conhecida como escaneamento confocal fora do eixo, pois o feixe escaneado é desviado para cada lado do eixo óptico e utiliza regiões periféricas dos elementos da lente objetiva. Algumas implementações pioneiras de técnicas de escaneamento no microscópio óptico utilizavam escaneamento sobre o eixo, no qual o feixe laser permanecia fixo sobre o eixo óptico e a varredura era feita na platina do espécime ou na objetiva.

Embora hipoteticamente os dois métodos de escaneamento possam produzir resultados semelhantes, os requisitos relacionados à escolha de uma objetiva para um desempenho ideal são significativamente diferentes para o escaneamento com iluminação sobre o eixo ou fora do eixo, e os fatores para a coleta da fluorescência emitida através da objetiva também são diferentes. Um terceiro tipo de escâner utiliza um disco giratório Nipkow para fazer a varredura de vários pontos de iluminação sobre o espécime sem precisar mover a fonte de luz ou a platina do microscópio. Os sistemas Nipkow são populares em pesquisas com células vivas por sua capacidade de minimizar os danos a células vivas em relação a configurações que empregam fontes de varredura a laser de alta intensidade.

É possível dividir em duas categorias as aberrações de lente que afetam o desempenho da objetiva, incluindo as aberrações que não são cromáticas (invariáveis conforme o comprimento de onda) e as aberrações cromáticas, que dependem do comprimento de onda. As aberrações cromáticas são caracterizadas por aberração cromática lateral ou aberração cromática longitudinal, enquanto o grupo que não depende do comprimento de onda inclui aberração esférica, coma, astigmatismo, curvatura de campo e distorção. As aberrações cromáticas e a aberração esférica afetam todo o campo de imagem, enquanto as outras aberrações são mais prevalentes nas zonas fora do eixo. As aberrações cromáticas e a aberração esférica (veja a Figura 2) têm maior probabilidade de afetar negativamente o desempenho confocal. Em geral, não é possível modificar aberrações cromáticas por via procedural, sendo necessário solucioná-las por meio do desenho dos componentes ópticos. Outros artefatos, especialmente a aberração esférica, costumam ser exacerbados pelo uso inadequado da objetiva ou pela introdução de componentes ópticos incompatíveis, sendo possível promover uma minimização ou compensação seguindo as técnicas adequadas ou realizando ajustes no sistema óptico.

Aberração esférica

A aberração esférica é a aberração não cromática mais significativa para o desempenho confocal, sendo uma manifestação da propriedade de componentes de lentes esféricas que faz os raios de luz para-axiais e periféricos serem focalizados em planos sucessivos. Diferentes graus de refração para trajetórias de raios através de diferentes zonas da lente resultam no embaçamento da imagem focalizada de uma origem de ponto, produzindo uma mudança assimétrica de intensidade acima e abaixo do plano focal. Em todas as objetivas modernas, a aberração esférica é corrigida para níveis visualmente imperceptíveis se as variáveis operacionais especificadas para o desenho da objetiva forem atendidos com exatidão. Infelizmente, na prática há muitas possibilidades que permitem o desvio dos critérios do desenho óptico da objetiva e de indução de aberrações esféricas. Como só é possível corrigir a aberração esférica de maneira adequada para uma relação de distância precisamente especificada entre a objetiva e o espécime e os planos de imagem, é possível introduzir o artefato acidentalmente se não houver a manutenção do comprimento do tubo especificado para a objetiva. Isso pode ocorrer se a objetiva for usada em um microscópio que tenha um comprimento de tubo diferente do necessário em um sistema com correção finita, ou mediante a introdução de elementos ópticos (p. ex., filtros) na trajetória do feixe convergente em tal sistema.

A correção ideal da aberração esférica requer atenção criteriosa ao meio de formação de imagem externo à objetiva, pois essa é outra possível origem de degradação do desempenho. As características da objetiva são estruturalmente imutáveis e não podem acomodar variações das condições operacionais (com a exceção de ajustes fornecidos por colares de correção). Entre os fatores capazes de adicionar níveis significativos de aberração esférica, estão óleo de imersão com baixa qualidade entre a objetiva e o espécime, espessura despadronizada da lamínula, o meio de montagem do espécime e o próprio espécime. Qualquer material que fique entre o espécime e a superfície frontal da lente da objetiva passa a ser um componente crítico do sistema de formação de imagem. A adesão aos requisitos do desenho da objetiva passa a ser ainda mais crucial com uma abertura numérica mais alta. Variações na espessura da lamínula ou em seu índice de refração podem aumentar a aberração esférica, especialmente com objetivas “secas” (sem imersão). Objetivas secas com alta abertura numérica costumam ser desenvolvidas para um desempenho ideal com uma lamínula com 0,17 mm de espessura e o espécime montado diretamente abaixo e em contato com o vidro.

Para viabilizar a correção da aberração esférica mediante o uso de lamínula com espessura não padronizada, há muitas objetivas equipadas com um colar de correção ajustável que pode ser definido de acordo com várias configurações de espessura. O colar de correção opera reposicionando um grupo interno de lentes a fim de alterar o comprimento focal da objetiva. Mesmo que haja o uso de uma lamínula com a espessura correta, a presença de uma camada de meio de montagem entre o vidro e o espécime diverge da situação óptica ideal e vai aumentar o grau de aberração esférica. Também é possível utilizar o colar de correção para minimizar a aberração esférica induzida por mudanças dessa natureza no índice de refração, que na microscopia confocal, causa a redução da intensidade no pinhole e a redução da diferenciação de profundidade em decorrência das mudanças no foco axial.

Normalmente, objetivas destinadas para imersão em óleo são otimizadas para uso com uma lamínula com 0,17 mm de espessura e índice de refração de 1,518 em comprimentos de onda específicos, além de um óleo de imersão com índice de refração precisamente definido. Ao especificar as condições operacionais relacionadas ao a e ao meio de imersão, é possível corrigir a aberração esférica por meio do desenho da objetiva para diversos valores de comprimento de onda (dependendo do tipo de objetiva). A importância da correspondência certa entre os índices refrativos de cada material ao longo da trajetória da luz, desde o espécime e o meio de montagem até o elemento de lente frontal da objetiva, tem sido historicamente um dos critérios mais problemáticos na formação de imagem, especialmente em tentativas de alcançar alta resolução com espécimes biológicos. O índice de refração de componentes subcelulares é consideravelmente inferior em relação ao meio convencional de imersão, e em muitos casos, esses índices de refração são indeterminados e variam por todo o espécime. Mesmo em materiais fixados, normalmente o índice de refração do meio de montagem não é idêntico ao índice dos óleos de imersão disponíveis.

Para investigações de processos dinâmicos em células vivas, que são cultivadas e mantidas em soro fisiológico, a disparidade dos índices de refração do óleo e da água resulta em uma limitação crítica para o desempenho de objetivas de imersão em óleo. O principal problema é que o potencial total das objetivas de imersão em óleo com abertura numérica mais alta não é alcançado devido à disparidade entre o índice de refração da água (1,33) e o índice de refração do óleo de imersão (aproximadamente 1,5). Um fator crítico na aplicação da microscopia confocal é a melhora nas imagens de fluorescência e na representação tridimensional de espécimes espessos, e a aberração esférica introduzida durante o uso de objetivas de imersão em óleo com espécimes aquosos limita a profundidade na qual é possível obter imagens aceitáveis no meio. Em geral, objetivas de imersão em óleo com abertura numérica alta são desenvolvidas para uso com planos de imagem que não estejam além de 15 a 20 micrômetros abaixo da lamínula. No entanto, quando aplicadas a espécimes aquosos, a aberração esférica induzida na interface entre água e lamínula pode atingir níveis substanciais a partir de 10 micrômetros. Como exemplo, as funções de dispersão de ponto ilustradas na Figura 3 demonstram o grau crescente de aberração esférica que ocorre com uma objetiva planapocromática de imersão em óleo a profundidades de penetração de 0 a 8 micrômetros.

O interesse no uso de técnicas confocais de fluorescência para a coleta de dados tridimensionais de espécimes biológicos aquosos foi um grande incentivo para que os fabricantes de microscópios lançassem várias opções de objetivas de imersão em água altamente corrigidas e com alta abertura numérica. Porém, a água tem duas desvantagens: ela seca facilmente, sendo pouco prática para formação de imagem com lapso de tempo em longo prazo, e tem um baixo índice de refração de 1,33, que impede o uso no desenho de objetivas com alta abertura numérica. Consequentemente, os fabricantes lançaram uma objetiva de imersão em óleo de silicone para essa finalidade, pois seu índice de refração de 1,4 é próximo ao índice de refração de células vivas e esse meio não seca. A aberração esférica é uma importante limitação óptica em estudos confocais de células vivas quando há o uso de objetivas de imersão em óleo, e os efeitos aumentam proporcionalmente à profundidade de observação em meio aquoso e componentes subcelulares variáveis (veja a Figura 3). Os efeitos negativos sobre a formação de imagem incluem a perda de contraste e intensidade de sinal devido a uma redução na fração de intensidade de fluorescência emitida que atinge o pinhole do detector, perda de resolução de características ínfimas do espécime e redução na exatidão da posição do eixo z, que afeta a integridade de reconstruções de imagem tridimensional. Ao utilizar objetivas de imersão em óleo de silicone na formação de imagem de espécimes em meio aquoso a profundidades significativas além da lamínula, é possível evitar ou minimizar a aberração esférica, permitindo a concretização de todos os benefícios da técnica confocal. As objetivas de imersão em óleo de silicone com grandes distâncias de trabalho são capazes de coletas dados tridimensionais precisos a profundidades superiores a 200 micrômetros em meio aquoso.

Independentemente do grau de correção óptica, uma objetiva de imersão em óleo não é a opção ideal para a formação de imagem de um espécime imerso em água. Nessa combinação, só é possível obter a qualidade ideal de imagem para regiões no espécime que estejam em contato direto com a lamínula. Em profundidades maiores, os efeitos da aberração esférica degradam o contraste e a resolução, reduzindo o brilho da imagem até o ponto em que a proporção confocal entre sinal e ruído é drasticamente reduzida. O uso de uma objetiva altamente corrigida de imersão em óleo de silicone é a solução ideal para minimizar a aberração esférica induzida na formação de imagem a grandes distâncias em meio aquoso.

Uma tática usada para corrigir a aberração esférica é a implementação de colares de correção em objetivas de imersão em água e em óleo de silicone. Esses colares de ajuste oferecem a correção variável para eventos de aberração esférica, p. ex., aqueles induzidos por flutuações na espessura da lamínula. Esse tipo de colar de correção também é útil na compensação de diferenças do índice de refração em meio fisiológico e em constituintes de células e tecidos, e para a variação do índice de refração em decorrência de mudanças na temperatura ou na concentração do soluto. Graças à variedade de fatores que podem contribuir para a indução da aberração esférica, a correção ajustável é um recurso desejável de uma objetiva para aplicações confocais mesmo diante do uso de uma lamínula com espessura ideal.

Aberrações ópticas fora do eixo

A aberração óptica comum conhecida por coma afeta principalmente fontes semelhantes a pontos que estejam distantes do eixo óptico, produzindo uma distorção radial semelhante a uma listra em pontos de imagem e cuja gravidade aumenta de acordo com o ângulo do campo (veja a Figura 4). O coma lembra a aberração esférica no sentido em que ambas as aberrações são potencialmente induzidas pelos mesmos fatores. Essa aberração é geralmente bem corrigida em sistemas ópticos modernos pela utilização de elementos adequados de lentes, e objetivas que eliminam o coma e a aberração esférica são classificadas como aplanáticas. Por ser uma aberração primariamente fora do eixo, o coma é significante para sistemas confocais de varredura a laser, que costumam utilizar trajetórias de feixe fora do eixo, mas não é um fator em microscópios confocais (sobre o eixo) de escaneamento de espécime.

Vários outros tipos de aberração geométrica são potencialmente significativos para o desempenho da objetiva confocal, e como todos ficam mais evidentes em regiões do campo de imagem mais distantes do centro, é mais provável que afetem o desempenho em sistemas confocais de varredura a laser. As exigências ópticas da formação de imagem confocal são tão altas que apenas óptica altamente corrigida apresenta probabilidade de desempenho adequado. Normalmente, aberrações geométricas significativas terão sido minimizadas em objetivas dessa categoria. No entanto, é benéfico ter ciência dessas aberrações e dos possíveis problemas que elas podem introduzir durante a escolha de objetivas, especialmente se houver a concessão de características específicas de desempenho para otimizar outra variável que possa ter maior importância em uma aplicação específica.

O astigmatismo não corrigido pode reduzir a intensidade, a nitidez e o contraste da imagem, com efeitos proporcionalmente maiores à distância em relação ao eixo óptico (Figura 4). Para definir a geometria de um ponto de imagem astigmático, podemos considerar dois planos ortogonais que compõem seções transversais através da frente de onda da imagem. Os planos (tangencial e sagital) em um sistema astigmático podem ter diferentes distâncias focais e exibir raios distintos para um ponto de espécime perfeitamente simétrico. Essa aberração resulta em características simétricas semelhantes a um ponto que estão localizadas fora do eixo, com alongamento radial ou tangencial no plano de imagem dependendo do foco. Mediante a escolha do melhor foco em uma posição de concessão entre os dois extremos, o disco de Airy resultante é assimétrico, resultando em degradação da imagem. O astigmatismo pode ser resultado de elementos inadequadamente centralizados em uma objetiva danificada ou de baixa qualidade, sendo aumentado por outros desalinhamentos na trajetória óptica do microscópio.

Nas imagens confocais, uma propriedade das lentes objetivas descrita como curvatura de campo ou planeza de campo também é uma grande preocupação para a formação de imagem com um campo de visão mais amplo, especialmente em cortes de tecido. Lentes esféricas simples focam em pontos de imagem de diferentes regiões em um espécime plano sobre uma superfície de imagem curva, refletindo a forma da superfície da lente. O plano de imagem reto não está de acordo com o plano curvo do foco, resultando na impossibilidade de focagem nítida simultânea das áreas central e periféricas do campo. Para corrigir essa curvatura de campo e expandir o tamanho da zona central do foco nítido, é necessário utilizar desenhos mais complexos de lente, consistindo em vários grupos de elementos de lente. Objetivas chamadas de campo plano ou planas têm correção óptica para produzir um campo amplo aproveitável com nitidez desde o centro até a margem, com o mínimo de curvatura de campo, no plano intermediário de imagem. A planeza do campo no plano final de imagem também depende dos elementos ópticos intermediários, inclusive das oculares do microscópio.

A não linearidade do aumento desde o centro até as margens do campo de imagem produz a distorção geométrica de características do espécime, fazendo com que seus verdadeiros perfis dimensionais fiquem distorcidos na imagem. Se estiver presente, esse efeito é prontamente observado na imagem de conjuntos ortogonais de linhas cruzadas. Em vez de aparecerem retas em todo o campo de imagem, as linhas ficam curvadas para fora ou para dentro em regiões distantes do centro do campo. Esses dois tipos de distorção costumam ser respectivamente chamados de distorção de barril e de alfineteira. Assim como observado para a curvatura de campo, pequenas quantidades de distorção geométrica costumam ter pouca significância em aplicações biológicas, mas podem ser cruciais em investigações na área de ciências dos materiais se houver a intenção de realizar análise de defeitos ou medições com precisão.

Aberrações cromáticas

As aberrações cromáticas são causadas por dois fenômenos ópticos fundamentais que exibem dependência do comprimento de onda e produzem diferentes tipos de defeito de imagem. Um tipo de aberração cromática é causado pelo fato de que índices de refração variam de acordo com o comprimento de onda para todos os vidros ópticos, enquanto o segundo tipo é resultado da variação de acordo com o comprimento de onda durante o aumento. A dependência do índice de refração sobre o comprimento (normalmente chamada de dispersão) produz uma diferença efetiva no comprimento focal para a luz de diferentes comprimentos de onda. Sendo assim, para uma lente simples que consista em uma só composição de vidro, só é possível focalizar um comprimento de onda (ou uma variação restrita de comprimentos de onda) com precisão no plano de imagem usando uma configuração específica de foco. Outros comprimentos de onda serão focalizados mais perto ou mais longe da lente. A dispersão espectral resultante por toda a extensão do eixo óptico é chamada de aberração cromática longitudinal ou, como alternativa, aberração cromática axial (veja a Figura 5). Para uma origem semelhante a um ponto com imagem obtida no eixo óptico, a gradação nos índices de refração faz com que a luz azul seja focalizada mais próximo da lente, com os comprimentos de onda mais longos convergindo em pontos focais cada vez mais distantes da lente. Caso não seja corrigida, é possível visualizar a aberração como franjas de diferentes cores quando a imagem for desfocada para qualquer um dos lados do melhor foco visual.

A aberração cromática longitudinal não corrigida em uma objetiva usada para microscopia confocal pode ter efeitos profundos, especialmente na formação de imagem de dois ou mais fluoróforos, que depende da capacidade de demonstrar a colocalização da emissão de fluorescência em vários comprimentos de onda. Quando há o uso de vários fluoróforos, a aberração cromática longitudinal faz com que os vários feixes de excitação a laser sejam focalizados em diferentes pontos no espécime, resultando na coleta de diferentes comprimentos de onda de emissão de pontos não coincidentes. Essa aberração anula a possibilidade de estabelecer posições exatas de fluoróforos na direção z para a geração de dados tridimensionais do espécime.

Em técnicas confocais de escaneamento, a avaliação do efeito de aberrações cromáticas sobre a integridade de imagens para um objetivo específico requer a consideração de todos os fatores que determinam a energia de sinal que passa por meio do pinhole e é registrada pelo detector. Esses fatores incluem o espectro de emissão do laser de excitação, o pico de emissão e a largura de banda de cada fluoróforo, além da sensibilidade espectral do detector. Normalmente, a correção da aberração cromática longitudinal é concretizada combinando vários elementos de lente com diferentes características ópticas no desenho da objetiva, e o grau de correção faz parte da base de classificação das objetivas em diferentes categorias (conforme abordado adiante).

A mudança do comprimento focal da lente conforme o comprimento de onda, que produz a dispersão axial característica da aberração cromática longitudinal, também é responsável pela ocorrência da aberração cromática lateral (veja a Figura 5). Como o aumento é inversamente proporcional ao comprimento focal, a variação do comprimento focal conforme o comprimento de onda produz uma dependência correspondente do aumento sobre o comprimento de onda. Caso essa aberração não seja corrigida na objetiva, as bordas agudas na imagem podem ficar envoltas por franjas nas cores azul ou vermelha. Em objetivas não corrigidas, o aumento do componente de comprimento de onda azul do sinal pode variar entre 1 a 2% em relação ao componente vermelho. Quando presente em um sistema óptico de escaneamento confocal, a aberração cromática lateral pode resultar em uma perda do sinal no pinhole, graças à possibilidade de que a luz emitida tenha a imagem formada em um local que seja mais próximo ou mais distante do eixo óptico em relação à localização efetiva do espécime, de acordo com a composição espectral da luz.

Como os dois tipos de aberração cromática estão relacionados, geralmente objetivas altamente corrigidas para aberração cromática longitudinal também exibem o mínimo de aberração cromática lateral. Os fabricantes de microscópios adotam diferentes abordagens para corrigir os diversos fatores que afetam o desempenho óptico, com a compatibilização cuidadosa dos componentes do sistema sendo essencial para obter uma correção máxima das aberrações. Na microscopia de fluorescência confocal, a aberração cromática lateral não corrigida resulta em problemas semelhantes aos observados no tipo longitudinal, com a introdução de erros no mapeamento das localizações dos fluoróforos que fazem emissão em diferentes comprimentos de onda.

Durante uma boa parte da história de fabricação dos microscópios ópticos, o padrão adotado para o desenho de objetivas exigia que a objetiva formasse uma imagem real em uma distância fixa específica em relação à superfície de montagem da objetiva, correspondendo ao plano focal frontal da ocular. Configurações baseadas na formação direta de uma imagem intermediária real pela objetiva são chamadas de sistemas finitos, com a distância até a imagem intermediária chamada de comprimento do tubo da objetiva. Embora durante um período os diversos fabricantes tenham padronizado seus sistemas ópticos finitos com a mesma distância parfocal e de comprimento do tubo, abordagens distintas foram empregadas para a compensação de aberrações de lente, sendo necessário levar esse fator em consideração se houver o uso combinado de componentes ópticos de diferentes fabricantes. É possível projetar sistema finitos para fornecer correção completa de aberração na objetiva, ou permitir a presença de um nível residual conhecido de aberração cromática lateral na imagem formada pela objetiva que será compensado pela ocular.

No sistema óptico infinito, os raios de luz que deixam a objetiva não são focalizados, mas permanecem paralelos até que sejam concentrados no plano de imagem intermediário por uma lente de tubo (ocasionalmente chamada de lente telan). A maioria dos fabricantes de microscópios desenvolveu sistemas ópticos com correção ao infinito. Esses sistemas têm um benefício intrínseco, pois os raios de luz da objetiva e focalizados ao infinito são relativamente insensíveis a componentes ópticos adicionais posicionados no “espaço infinito” entre a objetiva e a lente de tubo. Embora as lentes de tubo possam realizar algum nível de correção de aberrações residuais, há vantagens de versatilidade em desenhos que fornecem correção total na objetiva, com a lente de tubo sendo neutra no quesito óptico. A Figura 6 apresenta as trajetórias de luz focalizada ao infinito para microscópios comuns de fluorescência nos modelos vertical e invertido. A seta branca dupla em cada diagrama de microscópio indica o caminho paralelo da luz entre a abertura traseira da objetiva e a lente de tubo.

Diferentes fabricantes seguem diferentes especificações de projeto em seus sistemas infinitos, incluindo o comprimento focal da lente de tubo e o comprimento do espaço infinito. Sistemas ópticos com correção ao infinito permitem a movimentação da objetiva para a focalização em vez da movimentação da platina do microscópio, uma vantagem distinta em aplicações que exigem a manipulação delicada do espécime durante a observação. No entanto, o principal benefício prático do espaço infinito é a possibilidade de adição de componentes ópticos auxiliares (p. ex., analisadores de luz polarizada, filtros e prismas de contraste de interferência diferencial [DIC]) sem grandes preocupações relacionadas à espessura ou às propriedades de refração desses componentes. Desde que tenham superfícies paralelas planas, os elementos adicionados terão efeitos ínfimos sobre a qualidade da imagem. Por outro lado, em um sistema com correção finita não é possível posicionar componentes ópticos na trajetória do feixe (que está convergindo entre a objetiva e o plano de imagem intermediário) sem introduzir um desvio na imagem e outras aberrações que variam conforme a espessura e o índice de refração dos elementos adicionados.

Correção óptica em objetivas de microscópio

Independentemente do uso de um sistema óptico com correção finita ou infinita, é necessário levar em consideração os critérios combinados de desempenho das objetivas projetadas para o sistema ao determinar quais objetivas atenderão aos requisitos de uma técnica específica de formação de imagem. Normalmente, as objetivas são agrupadas em categorias de desempenho de acordo com o grau de correção óptica. Conforme discutido anteriormente, a importância relativa de diversas aberrações e os critérios de desempenho afetados dependem da maneira como a objetiva é usada e dos requisitos básicos da aplicação. Embora recentemente as categorias tradicionais de objetivas tenham ficado muito menos diferenciadas graças a avanços tecnológicos significativos nos processos de desenho e fabricação óptica, o agrupamento mais geral de objetivas costuma ser feito com base no grau de correção de aberração cromática. Uma boa parte da nomenclatura descritiva ainda é válida e amplamente usada, e a compreensão dos termos usados e de como eles estão relacionados a aplicações confocais é importante durante a avaliação das diversas objetivas disponíveis.

As aberrações cromáticas são resultado da dispersão no vidro óptico usado na fabricação de uma lente e costumam ser corrigidas por uma combinação de elementos de lente com diferentes propriedades de dispersão. Tradicionalmente, as objetivas que têm correção mínima para aberração cromática são categorizadas como acromáticas (veja a Figura 7) e costumam ser produzidas usando vidro com dispersão “normal”. Vidros desse tipo exibem uma diminuição praticamente linear do índice de refração com o aumento do comprimento de onda e incluem vidros crown e flint. O vidro crown costuma exibir um baixo índice de refração e baixa dispersão. Por outro lado, o vidro flint normalmente tem um alto índice de refração e alta dispersão. Em objetivas acromáticas mais antigas, dois ou mais elementos de lente desses tipos de vidro eram combinados para fornecer correção de aberração cromática, levando as luzes vermelha e azul para um foco comum, além de corrigir aberração esférica para luz verde. As objetivas acromáticas modernas costumam ter correção adicional para aberração esférica e correção significativa para curvatura de campo. Se a objetiva for corrigida para ampliar a planeza de campo sobre todo o campo de imagem, ela é chamada de planacromática. Em geral, objetivas acromáticas são adequadas para observação visual convencional de campo claro e para fotomicrografia e formação de imagem digital com a correção adicional (plana) para curvatura de campo.

Para que a objetiva alcance uma correção aprimorada de aberração cromática, é necessário usar tipos de vidro com dispersão anormal sobre uma parte do espectro. Em vidros que exibem mudança não linear do índice de refração com o comprimento de onda na região espectral do azul ou do vermelho, é possível compensar as aberrações cromáticas para habilitar o foco simultâneo de mais de dois comprimentos de onda. A fluorite cristalina foi um dos primeiros materiais descobertos como adequado para fornecer propriedades ópticas adequadas para a redução do espectro secundário não corrigido responsável pelas franjas verdes ou roxas ao redor de bordas agudas, que caracterizam imagens adquiridas com acromáticas. Combinados com diversos vidros ópticos, os elementos de fluorite proporcionam a capacidade de corrigir aberrações de lentes cromáticas para três comprimentos de onda (cores) e aberração esférica para dois comprimentos de onda. Além disso, essas objetivas altamente corrigidas têm características aprimoradas de transmissão na região espectral do ultravioleta.

Avanços tecnológicos mais recentes disponibilizaram novas fórmulas de vidro óptico e capacidades de modelagem de lentes que produzem propriedades de dispersão semelhantes às propriedades dos elementos de fluorite. Além disso, a maioria dos fabricantes produz uma linha de objetivas de flúor com correções ópticas próximas às correções da categoria mais elevada (Figura 7). Às vezes essas objetivas são chamadas de semiapocromáticas e podem ou não conter elementos de fluorite. Porém, por suas características ópticas, são apresentadas por diferentes fabricantes com nomes como Fl e PlanFl. As objetivas atualmente disponíveis nessa categoria são oferecidas com diversas configurações, incluindo modelos para uso com vários meios de imersão, e são adequadas para uso com campo claro, fluorescência, contraste de fase, luz polarizada e contraste de interferência diferencial, assim como com algumas aplicações confocais e multifotônicas.

Em geral, as objetivas classificadas como apocromáticas são as que têm o mais alto nível de correção para aberrações cromáticas e esféricas (veja a Figura 7). Essas objetivas costumam ter as mais altas aberturas numéricas disponíveis para uma determinada ampliação, com aberrações cromáticas e esféricas corrigidas para, no mínimo, três comprimentos de onda. Com correção praticamente total de aberrações, as objetivas apocromáticas são geralmente adequadas para qualquer técnica de microscopia, embora seja necessário fatorar todos os requisitos específicos de desempenho para a técnica que está sendo empregada. Apesar do grau excepcional de correção óptica exibido por apocromáticas, por utilizarem elementos de lente em duplas ou trios, algumas vezes elas sacrificam outras especificações importantes, como abertura numérica ou planeza. Técnicas mais novas de fabricação superaram essa concessão por meio de uma inovadora tecnologia de polimento de lentes que viabiliza a produção de lentes ultrafinas. Ao combinar lentes convexas e côncavas ultrafinas, essas objetivas alcançam transmitância superior e correção de aberração cromática em intervalos espectrais variando de violeta ao infravermelho próximo, abertura numérica mais alta e planeza expandida.

Aplicações de fluorescência confocal podem sofrer limitações graves se as aberrações cromáticas não forem corrigidas de modo similar para os comprimentos de onda de emissão e de excitação, um requisito que fica mais difícil de atender mediante a utilização de vários fluoróforos ou quando a diferença entre os comprimentos de onda de emissão e excitação é grande. Para alcançar o máximo de energia fotônica detectada, é necessário manter a parfocalidade entre o ponto de iluminação e a região detectada com imagem formada no pinhole. Mesmo na classe apocromática, muitas objetivas não oferecem correção adequada para técnicas de fluorescência que combinam excitação ultravioleta e emissão na região visível. Embora isso adicione custo e complexidade operacional considerável ao sistema confocal, é possível usar componentes ópticos adicionais na origem do laser ultravioleta para compensar a falha da objetiva na acomodação dos comprimentos de onda de intervalo mais amplo.

Objetivas de imersão em água e objetivas de imersão em óleo de silicone com alto desempenho são especificamente projetadas para satisfazer as exigências impostas pelas áreas de pesquisa que fazem formação de imagem de células vivas. Uma das principais metas é atingir desempenho ideal no microscópio de fluorescência confocal de espécimes biológicos, incluindo tecido e células vivas com suporte em meio fisiológico. Independentemente do nível de correção de aberração incorporado ao desenho de uma objetiva, é essencial reconhecer a possibilidade de introdução de outras aberrações na trajetória óptica fora da objetiva ao violar os requisitos operacionais do desenho e que isso pode degradar o desempenho dos melhores componentes.

Objetivas desenvolvidas para imersão direta ou imersão de contato em água, equipadas com nosecones especializados poliméricos ou em cerâmica, estão disponíveis para estudos fisiológicos e com células vivas. Essas investigações costumam exigir acesso ao espécime para medições ou outras manipulações e não é possível realizá-las sem a presença de uma lamínula. Em geral, objetivas de imersão de contato em água estão na categoria de fluorite, têm alta transmissão nas regiões espectrais ultravioleta e infravermelha, e são desenvolvidas com especificações de grande distância de trabalho e perfil de banda estreita da parte de inserção (contato) na ponta da objetiva. A ponta angular menor da objetiva foi desenvolvida para viabilizar o acesso máximo ao espécime para a conexão de microeletrodos ou para a realização de outras operações durante a observação. As grandes distâncias de trabalho, que podem alcançar vários milímetros em algumas objetivas desse tipo, também oferecem melhor acesso ao espécime. A parte de imersão de muitas objetivas de imersão é fabricada em cerâmica ou outro material isolante inerte visando proporcionar isolamento elétrico e resistência química. Essa combinação de características torna as objetivas de imersão de contato em água adequadas para as metodologias confocal, multifotônica e várias outras metodologias de formação de imagem com espécime vivo.

Além do aumento, da abertura numérica e do grau de correção óptica, a distância de trabalho de uma objetiva é particularmente importante na microscopia confocal e em outras técnicas de microscopia digital usadas para a aquisição de informações tridimensionais de espécime. Para uma objetiva que requer uma lamínula, a distância de trabalho é definida como a distância entre a superfície superior da lamínula e o elemento da lente frontal quando um plano de espécime em contato com a lamínula está focalizado (Figura 9[b]). A distância é importante quando a formação de imagem confocal é feita em várias profundidades no espécime, pois determina a profundidade máxima de penetração focal alcançável antes que a objetiva entre em contato com a parte superior da lamínula. Portanto, a distância de trabalho limita o alcance no eixo z no qual é possível coletar dados do espécime.

Por exemplo, é possível focalizar uma objetiva com uma distância de trabalho de 0,20 mm (200 micrômetros) até uma profundidade máxima de 200 micrômetros abaixo da lamínula antes que a objetiva entre em contato com a superfície superior da lamínula. É possível promover variações limitadas da distância de trabalho com o desenho óptico, embora esse elemento geralmente diminua conforme o aumento, a abertura numérica e a correção óptica aumentam. A manutenção de uma abertura numérica ampla e de um alto grau de correção de aberração com uma distância de trabalho longa é limitada por restrições geométricas simples impostas pelo formato dos elementos de lente e pelo número necessário em uma objetiva altamente corrigida. As especificações de muitas das objetivas atualmente disponíveis no mercado representam avanços extraordinários no desempenho concretizados pela disponibilidade de vidros ópticos, revestimentos de lente e capacidades de design computacional melhorados.

O fato de que a intensidade do sinal é proporcional ao quadrado da abertura numérica tem implicações para a escolha de objetivas ideais para a microscopia confocal e, em alguns casos, altera a importância relativa de diversos fatores de desempenho. Ao utilizar sistemas confocais de escaneamento com um recurso de aumento de varredura, raramente é necessário usar aumento óptico de 100X, e objetivas de 40X e 60X com alta abertura numérica e altamente corrigidas podem ser mais adequadas. Esses sistemas podem adquirir imagens de campo de visão amplo usando um aumento menor de varredura e imagens de estrutura subcelular em alta resolução usando um aumento maior de varredura.

Muitas técnicas populares, como a formação de imagem com imunofluorescência, sofrem inerentemente com baixos níveis de luz, fazendo com que as propriedades de transmissão do sistema óptico tenha importância crucial. Talvez apenas alguns fótons estejam disponíveis para a detecção de detalhes ínfimos do espécime e, como consequência, uma diferença relativamente baixa no percentual de transmissão no comprimento de onda de emissão ou de excitação do fluoróforo pode ser crucial para determinar a detectabilidade de uma característica marcada. Em algumas situações, as propriedades de transmissão da objetiva podem ter maior significado em relação a outras especificações, como planeza de campo e correção de aberração, que exigem revestimentos e elementos adicionais de lente que podem aumentar a perda de luz em uma banda essencial de comprimento de onda. No entanto, avanços na tecnologia óptica evitam essa concessão de transmitância ao empregar tecnologia exclusiva na fabricação de lentes.

A quantidade de técnicas especializadas aplicadas a problemas nas áreas de biologia celular e molecular, assim como em outros campos, resultou em mudanças nas demandas feitas dos sistemas de formação de imagem óptica, especialmente em relação à objetiva do microscópio. O aumento drástico no uso de técnicas de escaneamento confocal para investigações tridimensionais de espécimes biológicos exerceu uma grande influência nos produtos desenvolvidos comercialmente, embora métodos como aprisionamento a laser, excitação multifotônica, transferência ressonante de energia por fluorescência (Fluorescence resonance energy transfer, FRET), hibridização de fluorescência in situ (Fluorescence in situ hybridization, FISH) e contraste de interferência diferencial com infravermelho também tenham introduzido novos requisitos. Diversos parâmetros relacionados a técnicas especializadas deixaram evidente que existe a possibilidade do sacrifício ao menos parcial de alguns critérios tradicionais de desempenho de objetivas a fim de melhorar outras especificações mais cruciais. Avanços drásticos no desenho de lentes com auxílio computacional e nas formulações de vidro óptico, além dos avanços na tecnologia de revestimento antirreflexo, propiciaram a introdução de óptica aprimorada e capaz de satisfazer muitos dos novos requisitos com poucas ou nenhuma concessão na microscopia convencional de campo amplo. Alguns exemplos disso incluem objetivas de imersão em óleo de silicone com alto desempenho e abertura numérica mais alta, maior distância de trabalho, colares de correção de aberração esférica e objetivas com transmissão melhorada de ultravioleta e infravermelho. Além disso, objetivas fabricadas com lentes ultrafinas permitem que os pesquisadores alcancem alta abertura numérica, alta transmitância, correção de aberração cromática com alcance espectral mais amplo, além de expansão da planeza sem comprometer nenhuma dessas especificações.

Muitas objetivas modernas são adequadas para a microscopia confocal quando usadas de acordo com suas especificações de design. Investigações em alta resolução e processos de formação de imagens tridimensionais precisas de espécimes aquosos espessos usando um microscópio confocal de varredura a laser são operações particularmente desafiadoras e que exigem uma objetiva que satisfaça todos os seguintes critérios: alta abertura numérica para uma coleta eficiente da fluorescência, grande distância de trabalho para viabilizar uma profundidade máxima de penetração, campo plano para uma reconstrução tridimensional precisa, baixa aberração cromática axial para a parfocalidade de vários fluoróforos, baixa aberração cromática lateral para permitir o registro preciso de várias imagens de fluorescência, além de alta transmissão nos comprimentos de onda de excitação e de emissão.