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应用资料

Z漂移补偿系统IX-ZDC在单细胞水平多维度细胞实验中的应用


单细胞水平的多维度细胞实验

有助于高效多样本数据采集的细胞分析系统能够让研究人员在单细胞水平上观察剂量依赖的生理活性,从而研究生理反应和细胞变化。在这种类型的实验中,细胞通常在多孔板中培养。然后使用倒置显微镜观察将不同剂量药物添加到单个孔中时细胞所作出的生理反应。

带有z漂移补偿系统的倒置显微镜可执行持续数天的全自动连续观察,这对于监视细胞生长或测试药物毒性非常重要。对药物剂量影响的细胞生长和细胞内生理活性进行多维度成像对于细胞实验特别重要。

利用IX-ZDC Z轴漂移补偿模块有助于通过FRET生物传感器分析癌细胞对MEK抑制剂的耐药性

1)使用荧光能量共振转移(FRET)生物传感器将细胞外信号调节激酶(ERK)可视化

Ras-Raf-MEK- ERK信号通路与癌症发展的关联性众所周知,并且是分子化学疗法药物的靶标。但是,该通路与抗癌药耐药性的关系尚未明确。为了更好地理解Ras-Raf-MEK-ERK信号通路在抗癌药耐药性中的作用,日本京都大学医学院研究生院的研究人员使用FRET生物传感器分析了多种癌细胞对MEK抑制剂的耐药性,该生物传感器能够让研究人员将作为Ras-Raf-MEK-ERK信号通路组成部分的ERK蛋白激酶活性进行可视化。

图1.用于ERK或S6K活性可视化的FRET生物传感器结构

图1.用于ERK或S6K活性可视化的FRET生物传感器结构
FRET生物传感器分子中ERK或S6K衬底的磷酸化让其在分子内与磷酸肽结合域(WW或FHA1)结合,从而导致青色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)之间的FRET效率增加。

2)使用IX-ZDC Z漂移补偿器构建多维度细胞分析系统

在96孔位玻璃底微孔板上培养表达FRET的HT-29细胞(具有BRAF V600E突变)(图1)。在向各孔中添加不同剂量的MEK1 / 2抑制剂(AZD6244)后,使用全电动倒置奥林巴斯 IX系列显微镜连续3天观察每个孔细胞内ERK活性和细胞生长变化。每次对其中一个孔位成像时,IX-ZDC z轴漂移补偿器均会自动调整焦距,让研究人员即使在长期观察过程中也能捕捉到始终处于焦点的图像。

图2.将IX-ZDC Z轴漂移补偿器与多维度细胞生化分析系统结合使用
图2.将IX-ZDC Z轴漂移补偿器与多维度细胞生化分析系统结合使用
图像中的亮点对应于表达检测ERK活性所用FRET生物传感器的细胞核。
较暖和较冷的颜色分别表示ERK活性较高和较低。

3)MEK1 / 2抑制剂剂量依赖ERK活性和细胞生长速率的定量分析

为了从上述多维度细胞生化分析(图2)所获得的数据中分析HT-29细胞(带有BRAF V600E突变)对MEK1 / 2抑制剂(AZD6244)的剂量依赖反应,研究人员将MEK1 / 2抑制剂(AZD6244)浓度绘制在x轴上,将生长速率(/ 日)绘制在左侧y轴上并将ERK活性绘制在右侧y轴上,以此生成图表(图3)(使用在添加MEK1 / 2抑制剂后一天内生成的数据集)。为了分析MEK1 / 2抑制剂剂量依赖ERK活性与生长速率之间的关系,他们在x轴上绘制ERK活性并在y轴上绘制生长速率,由此生成第二个图表(图4)。这些图表表明,HT-29细胞在ERK活性和细胞生长速率上均表现出几乎相同的IC50值,并且ERK活性和细胞生长速率之间存在线性相关性。
 

图3.HT-29细胞ERK活性和细胞生长速率对于MEK1 / 2抑制剂(AZD6244)的剂量依赖反应图4.HT-29细胞MEK1 / 2抑制剂(AZD6244)剂量依赖ERK活性与细胞生长速率之间的关系

图3.HT-29细胞ERK活性和细胞生长速率对于MEK1 / 2抑制剂(AZD6244)的剂量依赖反应

图4.HT-29细胞MEK1 / 2抑制剂(AZD6244)剂量依赖ERK活性与细胞生长速率之间的关系

4)多种癌细胞系中的MEK1 / 2抑制剂剂量依赖ERK活性和细胞生长速率

通过在HT-29细胞以外的癌细胞系中重复进行相同分析,研究人员发现MEK1 / 2的ERK活性IC50值在各种癌细胞系中彼此相似(〜0.01μM);在具有MEK1 / 2耐药性的癌细胞系(KRas突变细胞系)中,细胞生长的IC50比ERK活性的IC50高出10倍以上,造成ERK活性与细胞生长速率之间存在非线性关系。

由于这项研究需要大量的成像数据,如果没有配合倒置IX系列显微镜使用的IX-ZDC z轴漂移补偿器,就无法有效分析癌细胞对MEK抑制剂的耐药性。

图5.多种癌细胞系ERK活性和细胞生长率的MEK1 / 2抑制剂(AZD6244)IC50值比较

图5.多种癌细胞系ERK活性和细胞生长率的MEK1 / 2抑制剂(AZD6244)IC50值比较

成像条件
显微镜:电动倒置IX系列显微镜。
Z轴漂移补偿系统:IX-ZDC
物镜:UPLSAPO20X,干式
微孔板:96孔位玻璃底微孔板

结论
IX-ZDC Z轴漂移补偿器可支持多维度细胞化验分析

奥林巴斯的IX-ZDC Z轴漂移补偿器和电动倒置IX系列显微镜可在持续多日的实验中实现针对微孔板各个孔内样品的清晰成像。利用自动聚焦功能,96孔板的完整成像可在大约2分钟内完成,*从而为高精度和快速细胞化验分析提供支持。

*用于在30毫秒曝光时间内对96孔板每个孔的一个点进行序列成像。

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利用 UCPLFLN20XPH拍摄单细胞水平的多维细胞成像

 

UCPLFLN20XPH在单细胞水平进行多维度细胞生化分析的视频

本应用指南的编写得到以下人员的帮助:
日本京都大学生物研究所研究生院生物成像与细胞信号实验室副教授Naoki Komatsu博士和日本京都大学医学研究生院时空信息成像平台专职副教授Kazuhiro Aoki博士。

有关本应用指南所述研究的更多详细信息,请参见:
Komatsu, N., Y. Fujita, M. Matsuda, 和K. Aoki。“通过ERK依赖基因表达变化所致mTORC1上调赋予致癌性KRas突变癌细胞对于MEK抑制剂的内在抗性。”Oncogene 34,第45期(2015):5607-5616

Products used for this application

Spinning Disk Confocal Super Resolution Microscope

SpinSR10

  • Live cell super resolution imaging
  • Observation at depth
  • A flexible system that helps simplify your research
全电动和自动化倒置显微镜系统

IX83

  • 独有的层式结构
  • 全电动系统
  • 系统解决方案
活细胞成像显微镜系统

IXplore Live

  • 利用奥林巴斯实时控制器采集生理相关数据,尽可能减小细胞干扰
  • 通过多种环境控制方案确保成像过程中细胞的活力
  • 使用TruFocus的时间序列实验中保持精确稳定的聚焦
  • 利用奥林巴斯硅油浸物镜还原真实的细胞形状
自动化显微镜系统

IXplore Pro

  • 方便进行实验设置的自动化多维观测功能,
  • 通过多孔板筛选进行数据的采集分析
  • 可采集大样品(如脑切片)的荧光全景图像
  • 通过反卷积提高分辨率和创建光学切片
  • 利用TruSight创建3D光学切片并提高分辨率
共聚焦显微成像系统

IXplore Spin

  • 利用转盘共聚焦系统进行快速的高分辨率共聚焦成像
  • 以更低的光毒性和光漂白对活细胞进行3D共聚焦时间序列成像
  • 利用X Line物镜的更高光线收集能力获得精准3D图像
  • 可根据您的研究进度和预算升级到IXplore SpinSR超分辨系统
超分辨率显微镜系统

IXplore SpinSR

  • 超级分辨率可让XY分辨率达到120 nm
  • 更低的光毒性和光漂白可以在共聚焦时间序列成像时降低对细胞活力的影响
  • 宽场、共聚焦和超分辨模式一键式切换
  • 使用世界首个数值孔径(NA)值1.5的平场复消色差物镜进行精确的3D重构*
    *截至2018年11月。根据奥林巴斯的研究。
TIRF显微成像系统

IXplore TIRF

  • 可用于膜动力学研究和单分子检测的同步多色TIRF
  • 单独穿透深度控制可提供多达四个标记物的精确共定位
  • 充分利用奥林巴斯全球最高1.7*数值孔径的TIRF物镜*(*截至2017年7月25日。根据奥林巴斯的研究)
  • 利用图形化实验管理员(GEM)模块简单直观设置复杂实验
用于培养观察的半复消色差物镜

UCPLFLN/LUCPLFLN

  • 在明场、微分干涉和荧光观察中,提供长工作距离通用型物镜,可以获得极佳的对比度和分辨率
  • 从高透过率的可见光到近红外光都能提供很好的平场成像效果
  • 专用于培养瓶和培养皿的组织培养观察
Z Drift Compensator

IX3-ZDC2

  • 随时保持焦点
  • 易用性设计
  • 专为活细胞影像设计
  • 通过cellSens软件实现高精度,多区域成像

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