단일 세포 수준에서 다차원 세포 기반 분석에 대한 Z-편차 보상 시스템 IX-ZDC의 적용

단일 세포 수준의 다차원 세포 분석

효율적으로 다중 샘플 데이터의 수집을 가능하게 하는 세포 기반 분석 시스템을 통해 연구원들은 단일 세포 수준에서 투여 의존적 생리학적 활동을 관찰하여 생리학적 기전에 의한 세포 반응을 연구할 수 있습니다. 이러한 유형의 분석에서 세포는 일반적으로 멀티웰 플레이트에서 배양됩니다. 그런 다음 도립현미경을 사용하여 각기 다른 투여량의 약제가 개별 웰에 추가될 때 세포가 어떻게 반응하는지에 대한 생리학적 반응을 관찰합니다.

Z-드리프트 보상 시스템을 사용한 도립현미경은 며칠 동안 완전 자동으로 연속 관찰을 수행할 수 있으며 이는 세포 성장 모니터링 또는 약제 독성 시험에 중요합니다. 다차원 약제 투여 의존적 세포 성장 및 세포 내 생리 활동의 이미지 획득 능력이 세포 기반 분석을 진행하는 데 중요합니다.

FRET 바이오센서를 사용하여 MEK 억제제에 대한 암세포의 저항을 분석하는 데 도움이 되도록 IX-ZDC Z-드리프트 보상기 사용

１）Förster 공진 에너지 전달(FRET) 바이오센서를 사용한 세포외 신호 조절 키나아제(ERK)의 시각화

Ras-Raf-MEK-ERK 신호전달 경로는 암 발병과의 연관성으로 유명하며 분자 화학요법 약제의 대상입니다. 하지만 이 경로의 항암제 저항과의 연관성은 불확실합니다. 항암제 저항에서 Ras-Raf-MEK-ERK 신호전달 경로의 역할에 대한 이해를 높이기 위해 일본 교토 대학 의학대학원의 연구원들은 Ras-Raf-MEK-ERK 신호전달 경로의 구성요소인 ERK 단백질 키아나제의 활동을 시각화할 수 있는 FRET 바이오센서를 사용하여 여러 암세포주 내 MEK 억제제에 대한 저항을 분석하였습니다.

그림 1. ERK 또는 S6K 활동의 시각화를 위한 FRET 바이오센서의 구조
FRET 바이오센서 분자 내 ERK 또는 S6K 기질의 인산화는 분자 내에서 인산펩티드-결합역(WW 또는 FHA1)에 결합시켜 청록색 형광 단백질(CFP) 및 노란색 형광 단백질(YFP) 간 FRET 효율을 증가시킵니다.

２）IX-ZDC Z-드리프트 보상기를 사용하여 다차원 세포 기반 분석 시스템 구성

FRET 발현 HT-29 세포(BRAF V600E 돌연변이 포함)(그림 1)를 96웰 유리 플레이트에 배양하였습니다. 다른 투여량의 MEK1/2 억제제(AZD6244)를 개별 웰에 추가한 후 완전 전동 도립 Olympus IX 시리즈 현미경을 사용하여 세포내 ERK 활동과 각 웰 내 세포 성장의 변화를 3일 동안 지속적으로 관찰하였습니다. IX-ZDC Z-드리프트 보상기는 각 웰의 이미지가 획득될 때마다 자동으로 초점을 조정하였으며 연구원들은 장기적 관찰 중에도 항상 초점이 맞는 이미지를 캡처할 수 있었습니다.

그림 2. 다차원 세포 기반 분석 시스템과 함께 IX-ZDC Z-드리프트 보상기 사용
이미지의 밝은 점들은 ERK 활동을 검출하기 위한 FRET 바이오센서를 발현하는 세포의 핵과 일치합니다.
따뜻한 색과 차가운 색은 각기 ERK 활동의 높고 낮은 수준을 나타냅니다.

３）MEK1/2 억제제 투여 의존적 ERK 활동 및 세포 성장률의 정량 분석

위에 설명된 다차원 세포 기반 분석(그림 2)에 의해 획득된 데이터에서 MEK1/2 억제제(AZD6244)에 대한 HT-29 세포(BRAF V600E 돌연변이 포함)의 투여 의존적 반응을 분석하기 위해 연구원들은 x축에 MEK1/2 억제제(AZD6244) 농도를, 좌측 y축에 성장률(/일)을, 우측 y축(MEK1/2 억제제의 추가 후 1일차까지 생성된 데이터 세트 사용)에 ERK 활동을 표시하여 그래프(그림 3)를 만들었습니다. MEK1/2 억제제 투여 의존적 ERK 활동과 성장률의 관계를 분석하기 위해 연구원들은 x축에 ERK 활동을, y축에 성장률을 표시하여 두 번째 그래프(그림 4)를 만들었습니다. 이들 그래프는 HT-29 세포가 ERK 활동과 세포 성장률에 대해 거의 똑같은 IC50 값을 나타냈으며 ERK 활동과 세포 성장률의 선형 상호관계가 있음을 보여주었습니다.
 

그림 3. HT-29 세포 내 MEK1/2 억제제(AZD6244)에 대한 ERK 활동 및 세포 성장률의 투여 의존적 반응	그림 4. HT-29 세포 내 MEK1/2 억제제(AZD6244) 투여 의존적 ERK 활동과 세포 성장률의 관계

４）여러 암세포주 내 MEK1/2 억제제 투여 의존적 ERK 활동 및 세포 성장률

HT-29 세포 외에 암세포주 내 동일한 분석을 반복하여 연구원들은 ERK 활동에 대한 MEK1/2의 IC50 값이 다양한 암세포주 내에서 서로 비슷하고(~0.01μM) MEK1/2 저항 암세포주(KRas 돌연변이 세포계)에서 세포 성장률에 대한 IC50이 ERK 활동에 대한 IC50 보다 10배 더 높으며 ERK 활동과 세포 성장률의 비선형 상호관계를 초래한 것을 발견하였습니다.

이 연구에는 대량의 이미징 데이터가 필요하였으며 도립 IX 시리즈 현미경에 대한 IX-ZDC Z-드리프트 보상기가 없었다면 암세포 내 MEK 억제제에 대한 저항의 효율적 분석이 불가능하였을 것입니다.

그림 5. 여러 암세포주 내 ERK 활동 및 세포 성장률에 대한 MEK1/2 억제제(AZD6244)의 IC50 값의 비교

이미징 조건
현미경: 전동 도립 IX 시리즈 현미경.
Z-드리프트 보상 시스템: IX-ZDC
대물렌즈: UPLSAPO20X, 건식
마이크로플레이트: 96웰 유리 마이크로플레이트

결론
IX-ZDC Z-드리프트 보상기가 다차원 세포 기반 분석을 지원합니다

Olympus의 IX-ZDC Z-드리프트 보상기 및 전동 도립 IX 시리즈 현미경을 통해 여러 날 지속된 실험에서 마이크로플레이트 내 개별 웰 안의 물질에 대한 이미지를 획득할 수 있습니다. 자동 초점 기능을 사용하면 약 2분* 내에 96웰 플레이트의 이미지를 완전히 획득할 수 있으며 고정밀 고속 세포 기반 분석을 지원합니다.

*30ms 노출 시간으로 96웰 플레이트의 각 웰 내 1개 점에 대한 순차적 이미징의 경우

단세포 수준의 다차원 세포 기반 분석에 대한 UCPLFLN20XPH의 동영상

이 애플리케이션 노트는 다음 연구원들의 도움으로 작성되었습니다.
Dr. Naoki Komatsu, 일본 교토 대학 바이오스터디 대학원 바이오이미징 및 세포신호 실험실 부교수 및 Dr. Kazuhiro Aoki, 일본 교토 대학 의학대학원 시공간정보를 위한 이미징 플랫폼 지정 부교수.

이 애플리케이션 노트의 연구에 대한 자세한 내용은 아래 글을 참조하십시오.
Komatsu, N., Y. Fujita, M. Matsuda, and K. Aoki. "mTORC1 upregulation via ERK-dependent gene expression change confers intrinsic resistance to MEK inhibitors in oncogenic KRas-mutant cancer cells." Oncogene 34, no. 45 (2015): 5607–5616