Microscopio confocal de escaneo láser
Microscopio confocal de escaneo láser
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La serie de microscopios FLUOVIEW FV3000 está desarrollada para afrontar los retos más importantes de la ciencia moderna. Gracias a la alta sensibilidad y velocidad requerida en el tratamiento de imágenes de células y tejidos vivos, el sistema FV3000 permite generar imágenes de nivel macro a micro en 2D-6D de células, tejidos y pequeños organismos. Con una interfaz de usuario intuitiva y adaptable, el sistema FV3000 soporta flujos de trabajo completos desde la adquisición de la imagen hasta el tratamiento y análisis. Se ha prestado una atención particular para satisfacer las necesidades que surgen de la biología celular, investigación del cáncer y la investigación de células madres; por consiguiente, con sus dos nuevas configuraciones verticales, el microscopio FV3000 satisface asimismo los requisitos de la neurociencia, electrofisiología y biología del desarrollo.
Microscopio confocal de escaneo láser
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Los microscopios de la serie FV3000 emplean la tecnología de detección TruSpectral de Olympus. Basándose en la transmisión del patentado holograma de fase volumétrica [Volume Phase Hologram (VPH)]* y en la ranura ajustable para controlar la luz, la detección espectral es altamente eficaz; ya que, permite que el usuario seleccione la longitud de onda de detección para cada canal de 2 nm.
* US8530824B/JP5541972B/EP2395380A
Eficiente sistema de detección TruSpectral
FV3000 es una serie de microscopios confocales completamente espectrales. La tecnología de detección TruSpectral proporciona una transmisión y sensibilidad general mejorada. La óptima relación entre señal y ruido permite obtener excelentes capacidades de imagen confocal multicolor.
Los tubos fotomultiplicadores GaAsP (PMT) en el detector de alta sensibilidad (HSD) del microscopio FV3000 permite visualizar muestras cuya emisión es muy débil para ser visualizadas mediante los métodos de detección convencionales. La unidad PMT GaAsP incorpora dos canales con una máxima eficiencia cuántica de 45 %; a su vez, el dispositivo de refrigeración Peltier reduce de 20 % el ruido parásito (de fondo) para proporcionar imágenes con una óptima relación entre señal y ruido bajo condiciones de luz de muy baja excitación.
El eficiente modelo de software que integra la tecnología TruSpectral permite que los detectores espectrales se ejecuten en modo multicanal ya sea para la separación espectral en vivo o postratamiento con un modo multicanal de configuración lambda. El modo multicanal facilita la separación espectral constante en experimentos de células vivas mediante la separación de fluorescencia compleja durante la adquisición. Incluso las señales espectrales brillantes y tenues, provenientes de 4 diferentes rangos dinámicos a partir de los 4 diferentes canales de una secuencia, pueden ser separadas mediante el ajuste de la sensibilidad en cada detector de forma independiente.
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El algoritmo de deconvolución permite que espectros superpuestos puedan ser separados en base a la información espectral a partir del apilamiento de imágenes de configuración lambda. La fluorescencia parásita entre los canales puede ser eliminada usando el algoritmo de separación durante la adquisición y el tratamiento pos-adquisición de ambas imágenes.
Separación espectral en vivo con tecnología de detección TruSpectral y tratamiento en tiempo real
La potencia de la detección TruSpectral más el modo multicanal significa que la separación espectral en vivo puede ser realizada durante la adquisición de la imagen. La superposición de espectros complejos puede ser procesada en tiempo real.
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Imagen en vivo antes de separación por CFP (endosomas, azul), mAmetrine (membrana plasmática, verde), mKO (núcleo, naranja) y mKeima (actina F, morado) durante el tratamiento de imagen en intervalos.
Datos de imagen por cortesía del Dr. Kazuhiro Aoki y del Dr. Michiyuki Matsuda, Facultad de posgrados en Medicina, Universidad de Kioto. | |
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Imagen borrosa separada en vivo.
Datos de imagen por cortesía del Dr. Kazuhiro Aoki y del Dr. Michiyuki Matsuda, Facultad de posgrados en Medicina, Universidad de Kioto. |
Visualice sus datos abiertos en tiempo real con la función de visualización de imágenes 3D en tiempo real del software FV3000. Las imágenes 3D pueden ser construidas durante la adquisición de imágenes y ser mostradas como imágenes en vivo.
Esferoide de línea celular HT29 inducido por células Fucci
Yuji Mishima, Ph.D.; Kiyohiko Hatake M.D., Ph.D. Clinical Chemotherapy, Cancer Chemotherapy Center, Japanese Foundation for Cancer Research [Quimioterapia clínica, Centro oncológico, Fundación japonesa para la investigación del cáncer].
Hallar las áreas de interés en muestras puede ser difícil. El diseño óptico confocal de los microscopios de la serie FV3000 soporta las imágenes de aumento macro a micro de 1,25X a 150X; de esta manera, es posible cambiar rápidamente la observación general de aumento bajo a una observación detallada de alto aumento de las áreas de interés. Los usuarios pueden usar la aplicación de tipo mosaico a nivel macro y micro para generar imágenes generales que muestran la muestra en contexto.
Imagen de tipo mosaico de una incisión coronal (grosor de capa de 30 μm) del cerebro de un ratón adulto YFP-H, adquirida mediante un objetivo de 20X (UPLSAPO20X).
Datos de imagen por cortesía de Takako Kogure y Atsushi Miyawaki, «Cell Function Dynamics», Instituto de Ciencias del Cerebro de RIKEN.
Potentes análisis macrométricos en un clic con el software cellSens
Las imágenes independientes no son suficientes. Con la función de análisis por recuento y medición del software cellSens, los microscopios de la serie FV3000 pueden optimizar las imágenes mediante la deconvolución y analizarlas mediante la función macro en un solo clic para un amplio rango de medidas morfológicas.
Imagen de un esferoide de una línea celular NMuMG expresada en Fucci2. Datos de imagen por cortesía de Atsushi Miyawaki, «Cell Function Dynamics», Instituto de Ciencias del Cerebro de RIKEN.
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El método de super resolución ampliamente aplicable de Olympus no requiere sustancias fluorógenas y sirve para un amplio rango de muestras. Idóneo para los análisis de colocalización, el módulo de imagen con super resolución de Olympus puede adquirir 4 señales fluorescentes, ya sean secuenciales o simultáneas, con una resolución de aproximadamente 120 nm*. Esto aumenta de casi el doble la resolución de la microscopía confocal
típica. El módulo de imagen es fácil de usar con una capacitación mínima y puede ser agregado a cualquier sistema confocal, lo que lo hace accesible para una plena aplicación de super resolución.
* Sujeto a aumento de objetivo, apertura numérica, excitación y emisión de longitud de onda y condiciones de experimento.
Anticuerpo secundario marcado contra proteína GFP (Alexa Fluor 488, neuronas) y SV2 (Alexa Fluor 565, roja). Muestra por cortesía del Dr. Ed Boyden y del Dr. Fei Chen, MIT.
La función opcional de deconvolución interactiva forzada mejora la resolución, el contraste y los rangos dinámicos de las imágenes confocales obtenidas mediante el sistema FV3000. La función de deconvolución puede ser combinada con la super resolución de Olympus (FV-OSR) para mejorar la resolución del eje Z de las imágenes tratadas por deconvolución.
Línea celular: HeLa (línea celular de cáncer cervical en humanos)
Inmunotinción: tinción con Hec1 (verde, Alexa Fluor 488), α-tubulina (rojo, Alexa Fluor-568), y DAPI (azul). Huso mitótico y cinetocoros teñidos con anticuerpos α-tubulina (rojo) y Hec1 (verde), respectivamente. Los cromosomas interactúan con los microtúbulos del huso mitótico a través de cinetocoros, estructuras proteicas dispuestas en la región centromérica de los cromosomas.
Datos de imagen por cortesía de Masanori Ikeda y Kozo Tanaka, Departamento Oncológico Molecular, Instituto de Desarrollo, Envejecimiento y Cáncer, Universidad de Tohoku.
Células COS7, tinción triple,
DAPI (cyan), Actina-Bodipy-FL (verde), Tubulina AF568 (rojo)
Datos de imagen por cortesía del Dr. Doehner y U. Ziegler, Centro para análisis de imágenes y microscopía, Universidad de Zurich
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El sistema FV3000 incorpora varias funciones analíticas opcionales para completar el flujo de trabajo desde la adquisición de la imagen hasta los análisis de datos. La solución de recuento y medición permite medir la cantidad, tamaño, luminosidad y morfología de los segmentos. La colocalización permite analizar la superposición del espectro de fluorescencia.
Los usuarios cuentan con dos opciones de unidad de escaneo: la galvanométrica que es suministrada solo con el microscopio FV3000, o la híbrida galvanométrico-resonante que es suministrada con el microscopio FV3000RS. La unidad de escaneo híbrida cuenta con un escáner galvanométrico para escaneos de alta precisión y, también, con el escáner resonante para imágenes de alta velocidad. Con el escáner galvanométrico y la tecnología de super resolución de Olympus (FV-OSR), los usuarios pueden obtener resoluciones por debajo de 120 nm con una óptima relación entre señal y ruido. El escáner galvanométrico también presenta opciones de escaneo flexibles que incluyen escaneos tornado precisos y la simulación multipunto con un tiempo de conmutación de 100 ms. El escáner galvanométrico puede adquirir imágenes de hasta 16 fotogramas por segundo. Al cambiar por el escáner resonante, los usuarios pueden capturar 30 fotogramas por segundo con un campo de visión completo de 512 x 512 píxeles. Recortando a 512 x 32 píxeles, el escáner resonante puede capturar hasta 438 fotogramas por segundo para recoger los eventos fisiológicos críticos en vivo, como el flujo de ion de calcio.
Ninguna concesión entre velocidad y campo de visión
Varios métodos de escaneo limitan el campo de visión, lo que limita su utilidad para examinar grandes áreas con múltiples células. El escáner resonante de la serie FV3000 mantiene un campo de visión completo de 1X, incluso en un video de 30 fotogramas por segundo. El recorte en B del eje Y otorga velocidad adicional de hasta 438 fotogramas por segundo.
La mayor parte de escáneres obligan a escoger entre velocidad y campo de visión. Los sistemas FLUOVIEW son optimizados para mantener el campo de visión con una intensidad de señal uniforme para que muestras dinámicas (p.ej., imagen de calcio) puedan ser visualizadas en el contexto más amplio de sus células y tejidos.
La imagen de arriba muestra ejemplos de campos de visión recortados requeridos en otros sistemas de escaneo.
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Plaquetas vinculadas a la trombosis en el torrente sanguíneo del ratón. Imágenes completas, capturadas en 30 fps con el escáner resonante, dotado de módulos fotomultiplicadores (PMT) con semiconductores GaAsP de 2 canales. Datos de imagen por cortesía del Dr. Takuya Hiratsuka, Dr. Michiyuki Matsuda, Facultad de posgrados en Biología, Universidad de Kioto. |
Células A431 fijadas con metanol marcado por protocolo Abcam para anticuerpo ERK1 + anticuerpo ERK2 (Alexa Fluor 488) ab208564 y anticuerpo alfa-tubulina (Alexa Fluor 594) ab195889 y DAPI. Muestra por cortesía de Abcam.
Optimizado para imágenes de células vivas
El escaneo resonante reduce significativamente el fotoblanqueo y la fototoxicidad en comparación con los escaneos galvanométricos estándares mediante la prevención de la excitación de fluorocromos en estado triplete que crean especies de oxígeno reactivo. Esta función hace los experimentos con células vivas más sólidos y confiables. Los microscopios de la serie FV3000 se dotan de un control de intensidad láser completo que va desde un rango bajo a alto, lo que permite usar la cantidad mínima requerida de potencia del láser en la muestra. El monitor de potencia del láser opcional proporciona una tensión de alimentación láser uniforme durante imágenes en intervalos de períodos prolongados a lo largo de múltiples días.
El análisis de imágenes por relación con el FV3000 emplea una función de visualización modulada de intensidad (IMD) del software que permite mostrar la relación de fluorescencia cuantitativa durante las adquisiciones estándares y de alta velocidad. Esta función es particularmente útil para obtener imágenes de calcio y de transmisión de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) en donde una visualización de relación pura proporciona poco contraste en áreas de fondo.
La proteína tsGFP1-mito revela la heterogeneidad en termogénesis mitocondriales en células HeLa.
Imágenes de relación (ex 405 nm/ex 488 nm) en tsGFP1-mito expresando células antes y después de tratamiento CCCP a 37 °C. Barra de escala indicando 10 μm (toda la imagen) y 3 μm (recuadro). Datos de imagen por cortesía de Shigeki Kiyonaka, Ph.D y Yasuo Mori, Ph.D. Sector de Biología Celular, Facultad de Química sintética y Química biológica, Universidad de Kioto.
Cardiomiocito
Datos de imagen por cortesía de Yusuke Niino y Atsushi Miyawaki, «Cell Function Dynamics», Instituto de Ciencias del Cerebro de RIKEN.
El escaneo de alta velocidad con baja potencia del láser para evitar fototoxicidad reduce generalmente la relación entre señal y ruido. Con el postproceso promedio de laminación, los usuarios cuentan con la flexibilidad para ajustar imágenes en intervalos de alta velocidad manteniendo asimismo la escala de tiempo y los datos originales.
Datos adquiridos sin tratamiento en 30 fps con baja potencia del láser (0,05 %, 488 nm) [izquierda]. Proceso promedio de laminación (10 fotogramas) en datos adquiridos en 30 fps con baja potencia del láser [derecha].
Con las imágenes en intervalos, el desplazamiento de objetos puede ser detectado, seguido y analizado automáticamente. La función de seguimiento del software cellSens brinda una potente e intuitiva herramienta para procesos dinámicos de cuantificación como el movimiento y división celular.
Bioluminescencia de células diferenciadas, inducidas por efecto de RA (ácido retinoico) en el día 12 a partir de células madres embrionarias (ES) estables transfectadas [Bmal1:luc]
Datos de imagen por cortesía de: Kazuhiro Yagita, M.D., Ph.D. Facultad de Fisiología y Biosciencia de sistemas, Universidad de Medicina de la Prefectura de Kioto
Referencia: Proc Natl Acad Sci U S A. 107(8): 3846–3851（2010）
El compensador de deriva en Z IX3-ZDC2 usa luz infrarroja de mínima fototoxicidad (clase de láser 1) para identificar la ubicación del plano de la muestra. El modo autoenfoque (AF) en una sola toma otorga varias posiciones de enfoque para configurarlas según lo requerido para muestra profundas, lo que permite adquisiciones en pila de Z en experimentos de múltiples posiciones. El modo continuo AF mantiene el plano de observación deseado en el enfoque preciso, evitando la pérdida de enfoque debido a los cambios de temperatura o la adición de disolventes líquidos. Esto es ideal para las mediciones que requieren un enfoque más rígido. Además, el desplazamiento óptico incrementado permite un autoenfoque continuo al usar recipientes de plástico o con objetivos secos. El compensador de deriva en Z también es compatible con los objetivos en silicona (en el modo de autoenfoque).
Haga clic aquí para obtener detalles acerca de IX3-ZDC2
Los intervalos y la aplicación mosaico de múltiples áreas proporcionan datos en intervalos precisos y contundentes. Estos permiten generar imágenes completas y detalladas para visualizar sus datos en contexto. La función del navegador por pocillos brinda controles sofisticados e intuitivos para una amplio rango de recipientes y placas personalizadas de cultivos.
La guía de desplazamiento en Z, instalada cerca del portaobjetivos giratorio, combina alta resistencia térmica con la estabilidad de una estructura de envolvente para reducir significativamente el impacto del calor y vibración, y para mejorar la calidad de las imágenes en intervalos.
Haga clic aquí para obtener más detalles acerca del microscopio invertido IX83
El microscopio posee una función de grabación en disco duro (HDD). Las imágenes son almacenadas automáticamente en el disco duro. Los datos voluminosos, como los que se obtienen a partir de imágenes en intervalos de períodos prolongados, pueden ser reunidas fácilmente.
La unidad de penumbra está desarrollada para observaciones por fluorescencia bajo ambientes luminosos. Esta bloquea eficazmente la luz del ambiente, aumentando el contraste de fluorescencia y facilitando la observación más clara sin necesidad de estar en un cuarto oscuro.
Gracias al módulo del administrador de secuencia, los protocolos complejos son tratados fácil y rápidamente. Los experimentos en intervalos de múltiples días son controlados con la precisión del escaneo en microsegundos y la precisión de ejecución de la secuencia en milisegundos. Es posible realizar varios protocolos, como el lapso de tiempo en diferentes intervalos, el intercambio entre el aumento alto y bajo, y la fotoestimulación entre las imágenes con FRAP o FRET (fotoblanqueo de un aceptor).
El módulo de análisis de Ciencias de la vida del software cellSens permite analizar imágenes a partir de experimentos con FRAP o FRET. En la recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP), el τ/2 y la fracción movible/inmóvil pueden ser estimados mediante su fijación a la curva de cambio de luminosidad. La función de transmisión de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) permite medir la eficiencia de FRET mediante el fotoblanqueo de un aceptor, la imagen por relación y la emisión sensibilizada.
Olympus ofrece 4 objetivos de inmersión en silicona con una alta amplitud numérica que brinda un excelente rendimiento para imágenes de células vivas. El índice de refracción del aceite de silicona (ne≈1,40) es muy similar al del tejido vivo (ne≈1,38), lo que permite realizar observaciones de alta resolución en profundidad dentro del tejido vivo, minimizando la aberración esférica debida a diferencias entre los índices de refracción. El aceite de silicona no se seca ni se endurece, por lo que no es necesario volver a administrarlo. Esto lo hace ideal para observaciones en intervalos prolongados.
En la observación de profundidad dentro del tejido, la calidad de imagen depende de la conservación del índice de refracción de la muestra y de la posible cercanía del medio de inmersión entre sí. Al trabajar con un objetivo de inmersión en silicona, la diferencia entre el índice de refracción de las muestras y el aceite de silicona es mínimo. Por lo tanto, se obtienen imágenes más brillantes con una elevada resolución para observaciones en profundidad dentro del tejido.
UPLSAPO30XS: para una visualización más amplia y de mayor profundidad
Aumento: 30X, A. N.: 1,05 (inmersión en aceite de silicona), D. T.: 0,8 mm;
espesor cubreobjetos: 0,13 - 0,19 mm; temperaturas de operación: 23 - 37 °C
UPLSAPO40XS: para una buena compensación entre el campo de visión y la resolución
Aumento: 40X, A. N.: 1,25 (inmersión en aceite de silicona), D. T.: 0,3 mm,
espesor cubreobjetos: 0,13 - 0,19 mm; temperaturas de operación: 23 - 37 °C
UPLSAPO60XS2: para observaciones 3D con resolución superior
Aumento: 60X, A. N.: 1,30 (inmersión en aceite de silicona), D. T.: 0,3 mm,
espesor cubreobjetos: 0,15 - 0,19 mm; temperaturas de operación: 23 - 37 °C
UPLSAPO100XS: para mayor brillo en profundidad en regiones concretas
Aumento: 100X, A. N.: 1,35 (inmersión en aceite de silicona), D. T.: 0,2 mm,
espesor cubreobjetos: 0,13 - 0,19 mm; temperaturas de operación: 23 - 37 °C
Este objetivo de inmersión en aceite minimiza la aberración cromática lateral y axial en el espectro de 405 a 650 nm. Las imágenes de colocalización son adquiridas de manera confiable y las imágenes son medidas con una precisión superior de posición. El objetivo también compensa la aberración cromática y la luz infraroja cercana de hasta 850 nm. Esto lo hace idóneo para imágenes cuantitativas.
Objetivo de baja aberración cromática
Aumento: 60X
A. N. 1,4 (inmersión en aceite)
D. T.: 0,12 mm
Rango de compensación de aberración cromática: 405 - 650 nm
Especificaciones ópticas para cada objetivo
Comparación de rendimiento entre los objetivos PLAPON60XOSC2 y UPLSAPO60XO
El collar de corrección ajusta la posición de lente para corregir la aberración esférica causada por la diferencia del índice de refracción. Esto resulta en un mejoramiento de la calidad de imagen, como la resolución, el brillo y el contraste. El collar de corrección es especialmente necesario para objetivos con una alta amplitud numérica cuando son usados para imágenes de resolución superior; ya que, son afectados considerablemente por la aberración esférica. La unidad de collar de corrección a distancia es útil para realizar ajustes rápidos y mejorar la calidad de la imagen; puede ser operador en todos los objetivos UIS2 que tienen un collar de corrección.
Diseños de pantalla personalizables y almacenables facilitan la adaptación de la interfaz a su flujo de trabajo y necesidades experimentales ya sean básicas o complejas.
Diseño de pantalla
Inicie seleccionado su diseño de pantalla preferido con las herramientas específicas para una adquisición básica o compleja.
Condición de adquisición
Recargue los ajustes que han servido en su último experimento para mayor uniformidad.
Adquisición
Ejecute adquisiciones básicas o complejas con una relación en vivo, visualización modulada de intensidad, gráficos cuantitativos del área de interés (ROI) o visualización de separación espectral, y un almacenamiento de datos con copias de seguridad para mayor seguridad.
Visor (Viewer)
Revise los datos tal como son generados. Cree vistas en 3D y 4D, y animaciones para explorar y compartir datos de manera detallada.
Análisis
Extraiga datos de las imágenes con el procesamiento en línea o fuera de línea. Las herramientas analíticas incluyen la tecnología de super resolución de Olympus (FV-OSR) y el potente software cellSens con las siguientes funciones: deconvolución, filtro, recuento y medición, y macro en un clic.
El microscopio confocal de escaneo láser FV3000 es compatible con una variedad de objetivos que van de 1,25x a 150x, lo que permite visualizaciones a nivel macro y también la adquisición de imágenes de alta resolución. Obtenga imágenes de secciones de tejido del cerebro completo para identificar fácilmente áreas de interés; posteriormente, cambie a un objetivo de alto aumento para adquirir imágenes de alta resolución de las neuronas meta. Es posible observar hasta la estructura más fina de las espinas dendríticas con la tecnología de super resolución de Olympus.
Gracias a la tecnología de detección TruSpectral, es posible representar las neuronas marcadas con múltiples colores y separar claramente el espectro individual.
Hemisección cerebral de ratón incrustada para microscopía de expansión (expansión preliminar), marcado con anticuerpos secundarios contra proteínas GFP (Alexa Fluor 488, verde), SV2 (Alexa Fluor 565, rojo) y Homer (Alexa Fluor 647, azul). Muestra por cortesía del Dr. Ed Boyden y el Dr. Fei Chen, MIT
Dendrita (anticuerpo de proteína GFP-Alexa Fluor 488, verde) y marcador sináptico (SV2 - Alexa Fluor 565, rojo). Imágenes de super resolución de Olympus tratadas con la función de deconvolución interactiva forzada del software cellSens. Mediciones promedio de anchura de media altura de ~135 nm Imagen adquirida con objetivos en silicona de 100X y apertura numérica de 1,35. Muestra por cortesía del Dr. Ed Boyden y del Dr. Fei Chen, MIT
Esta configuración ofrece un espacio de trabajo más amplio; por lo tanto, existe una disposición física más amplia alrededor del objetivo para equipamiento electrofisiológico. Es posible agregar más espacio al bajar la altura de la platina para dar cabida a experimentos que involucran muestras grandes. Los fenómenos rápidos, como las dinámicas del ion calcio que están relacionadas con la transmisión de señal neural, pueden ser
capturados hasta con 438 fotogramas por segundo con el escáner resonante disponible.
Con la caja de interfaz de entrada y salida TTL, es posible sincronizar la adquisición de imágenes mediante experimentos electrofisiológicos. Además, es posible usar un kit de desarrollo de software para control a distancia con el fin de controlar el microscopio FV3000 y el equipamiento electrofisiológico a partir de una sola plataforma de software.
Haga clic aquí para obtener más detalles acerca del estativo del microscopio vertical
La biología celular requiere un sistema de imagen de alta sensibilidad para minimizar la fototoxicidad de organismos vivos, como el pez cebra y el C.elegans. La imágenes de grandes partes de tejidos y pequeños organismos pueden requerir velocidades altas y también campos de visión grandes para ver el organismo completo en contexto, por lo tanto se requiere una excelente óptica de precisión automática. El sistema FV3000 está desarrollado para tratar imágenes de grandes tejidos y pequeños organismos con un control de platina adecuado, una aplicación de mosaico y una estructura óptica que facilita el aumento de bajo a alto (de 1,25X a 150X). Para facilitar la supresión de la autofluorescencia a partir de la señal de detección, el sistema espectral completo viene equipado con un software de separación espectral que permite separar la autofluorescencia y la superposición espectral (p.ej., GFP/YFP).
Frecuentemente, los pequeños organismos son preferidos como modelos para estudiar los procesos dinámicos en vivo, como las dinámicas del torrente sanguíneo, la señalización del calcio; por ello, el FV3000RS está equipado con un escáner resonante altamente preciso para capturar eventos hasta en 438 fotogramas por segundo. Mediante el proceso promedio de laminación, los usuarios pueden mantener una baja potencia láser para evitar fototoxicidad, mejorar la relación entre señal y ruido, y mantener la escala de tiempo original. Para aplicaciones como las imágenes de FRET y calcio, la función de análisis de imágenes por relación puede usar una visualización modulada de intensidad (IMD) para que la verdadera señal sobresalga del ruido de fondo.
Cuando se requieren imágenes de alta resolución, los usuarios pueden intercambiar en un clic entre el escáner galvanométrico de alta precisión y el escáner resonante de alta velocidad. El escáner resonante mantiene el mismo campo de visión para que los usuarios no pierdan su punto de observación al efectuar el intercambio entre el escaneo de alta velocidad y el escaneo de alta precisión.
Visualización modulada de intensidad del resultado de relación CFP/YFP durante contracciones espontáneas de un cardiomiocito in vitro, mostrando múltiples puntos de tiempo de células vivas. Se muestra a continuación el resultado gráfico cuantitativo de la relación de un área de interés dentro de la célula.
Datos de imagen por cortesía de Yusuke Niino y Atsushi Miyawaki, «Cell Function Dynamics», Instituto de Ciencias del Cerebro de RIKEN.
La serie FV3000 incorpora las tecnologías necesarias para los estudios de imágenes asociados a la investigación del cáncer. En los estudios de células vivas cancerígenas, la detección sensible a la fluorescencia, la óptica optimizada y las herramientas analíticas (como el recuento celular y los análisis de segmentación) son fundamentales. Con el surgimiento de microfluidos y un enfoque hacia las células tumorales circulantes, una
adquisición de alta velocidad puede hacer la diferencia entre un experimento exitoso o erróneo.
La precisión y repetibilidad son de igual importancia; los tiempos de control del ciclo celular deben ser seguidos fiablemente; las imágenes 3D de células deben representar correctamente su forma y tamaño; las imágenes también requieren ser brillantes y claras para el análisis de segmentación. Nuestros objetivos en silicona son optimizados para imágenes 3D de tejidos mediante la correspondencia cercana al índice de refracción de tejidos
vivos. Esto permite generar representaciones volumétricas más precisas. Al ser combinadas con la unidad de detectores GaAsp enfriados de alta sensibilidad, las imágenes brillantes con una óptima relación entre señal y ruido pueden ser alcanzadas fácilmente para obtener resultados precisos y reproducibles.
En la investigación del cáncer, es importante saber que la apoptosis es parte del experimento y no es causada por la fototoxicidad. La alta sensibilidad del FV3000 combinado con el monitor de potencia del láser y la potencia seleccionable del láser por debajo del 0,01 % ayuda a minimizar la fototoxicidad para datos fisiológicos en imágenes precisas. La sensibilidad y precisión espectral del sistema permite que los investigadores conduzcan experimentos con
marcado de fluorescencia multicolor usando múltiples biomarcadores sin temor a estresar la célula debido a la prolongada exposición láser.
Imagen de torrente sanguíneo y medición de velocidad mediante el análisis con el hemodinamómetro del software cellSens.
Datos de imagen por cortesía del Dr. Takuya Hiratsuka, Dr. Michiyuki Matsuda, Facultad de posgrados en Biología, Universidad de Kioto.
Célula NK (asesina natural) mediada por eliminación de células después de aplicación anticuerpo terapéutico ( azul). Proteína GFP marcada por células NK (verde) Tinción DAPI para células muestras (rojo) Datos de imagen por cortesía del Dr. Yuji Mishima, Cancer Chemotherapy Center, Japanese Foundation for Cancer Research [Centro oncológico, Fundación japonesa para la investigación del cáncer]. |
La investigación del cáncer es compleja pero medir su proliferación con el microscopio FV3000 no lo es. Gracias a las capacidades macrométricas del software cellSens, las imágenes en intervalos pueden ser procesadas y contadas; además, es posible generar informes con un simple clic. El diseño de pantalla del software de adquisición puede ser personalizado conforme con las aplicaciones específicas y ser seleccionado inmediatamente al iniciarlo, lo que hace el flujo de trabajo coherente y adecuado para las necesidades del usuario. Es posible cargar nuevamente condiciones experimentales específicas, con el fin de reproducir resultados.
Conteo de ciclos y expansión de la célula Fucci mediante el software cellSens con una visualización de múltiples puntos de tiempo de una populación de células en crecimiento, segmentada por colores en función del tiempo. El gráfico inferior efectúa el seguimiento asociado a la cantidad de poblaciones en función del tiempo.
Datos de imagen por cortesía de Atsushi Miyawaki, «Cell Function Dynamics», Instituto de Ciencias del Cerebro de RIKEN.
El administrador de secuencia permite tratar imágenes en intervalos variables.
El administrador de secuencia permite tratar imágenes en intervalos de diferentes duraciones, múltiples ciclos de cierre anidados e intercambios entre el escaneo galvanométrico y el escaneo resonante en el mismo experimento.
Las imágenes de células madres requieren altos niveles de automatización y capacidades de intervalo en períodos prolongados. El sistema FV3000 ha sido desarrollado para capturar imágenes de células durante múltiples días con una precisión de tiempo adecuada, baja fototoxicidad y un enfoque más exacto. Para mantener el enfoque durante el tratamiento de imágenes en intervalos dentro de microplacas, el sistema puede ser optimizado con un
compensador de deriva en Z (IX3-ZDC2). Para experimentos prolongados, agregue el monitor de potencia del láser para mantener una exposición láser uniforme y ofrecer de esta manera una excelente estabilidad láser.
Los usuarios que tratan imágenes de células vivas benefician de: una detección de alta sensibilidad, objetivos en silicona, baja fototoxicidad en el caso del escaneo resonante, y mayor rendimiento a partir de los escaneos de alta velocidad. Un control preciso de estimulación significa que la fotoconversión sea simple y eficaz aplicando una estimulación adecuada a las células y proporcionando imágenes capturadas a través de múltiples
días para un seguimiento de linaje celular. El software y el sistema de automatización FV3000 hacen que los flujos de trabajo sean simples, ya sea si los cultivos de células madres se encuentran en microplatos, placas individuales o dispositivos de microfluidos. El navegador de platina incluye la función de navegación de placa de pocillo y facilita el almacenamiento, modificación y recarga de los ajustes de placa y las condiciones de adquisición
frecuentemente usados. Los usuarios pueden observar rápidamente caminos individuales en la imagen de conductos de microfluidos. El administrador de secuencia facilita la configuración para capturar imágenes en intervalos durante períodos prolongados. Los usuarios pueden ajustar la velocidad y el período de adquisición conservando un análisis cronometrado. Visualice y descargue rápidamente datos de imágenes 3D y 4D preparados para publicación
y presentación con el software de representación intuitiva, incluido en el paquete de programas FV3000. Una vez que el tratamiento de imagen ha sido completado, la funcionalidad macro en el análisis del software cellSens facilita el recuento y segmentación celular en 2D con un simple clic.
Modelo de tejido MatTek EpiDermFT: Inmunofluorescencia marcada con 6 objetivos de interés. 1. Protocolo Abcam para DRAQ5 ab108410, 2. Protocolo Abcam para anticuerpo GAPDH (Alexa Fluor 405) ab206372, 3. Protocolo Abcam para anticuerpo Tubulina (Alexa Fluor 488) ab1955883, 4. Protocolo Abcam para anticuerpo Fibrillarin (Alexa Fluor 568) ab202540, 5. Protocolo Abcam para anticuerpo Vimentina (Alexa Fluor 594) ab154207, 6. Protocolo Abcam para anticuerpo Ki67 (Alexa Fluor 647) Muestra por cortesía de MatTek.
Tanto el microscopio FV3000 y el microscopio FV3000RS cuentan con una variedad de funciones avanzadas para aplicaciones, suministradas de forma estándar u opcional; por ejemplo: la función de super resolución (FV-OSR), la foto estimulación, la separación espectral y el combinador de haz externo. Combinando el control preciso del láser y la función de super resolución patentada por Olympus, la serie de microscopios FV3000 permite adquirir imágenes
con una resolución por debajo de los 120 nm, similar a los métodos de iluminación estructurados. La separación espectral es sólida para una variedad de aplicaciones mientras que la fotoconversión y la fotoestimulación son funciones eficientes y precisas que permiten el estudio de escaneos de trayectorias de ajuste y gráficos de estimulación.
El administrador de secuencia facilita el cumplimiento confiable de los protocolos de imagen para ciclos complejos de células. Las aplicaciones avanzadas, como el acceso aleatorio o escaneo de trayectoria de ajuste, permiten obtener medidas de fluorescencia de múltiples puntos manteniendo una óptima relación entre señal y ruido para estudios de señalización de células neurales in vitro, mientras que el procesamiento y activación en tiempo real
ayudan a proporcionar un control de tiempo preciso y coordinado para los dispositivos de perfusión TTL, estimuladores u otros periféricos de terceras partes. La función macro a micro es fácil de usar gracias al navegador de platina, el sistema de automatización integrado en el microscopio IX83 y la capacidad para guardar y recargar diseños de pantalla del software, flujos de trabajo y condiciones de experimentos.
| FV3000 | FV3000RS | ||
| Combinador láser principal | Láser de luz violeta/visible |
405 nm: 50 mW, 488 nm: 20 mW, 561 nm: 20 mW, 640 nm: 40 mW
Puerto láser opcional para combinador sub-láser o unidad láser opcional | |
|---|---|---|---|
| Láser opcional | Combinador sub-láser |
Cantidad máxima de 3 unidades láser:
445 nm: 75 mW, 514 nm: 40 mW, 594 nm: 20 mW, fibra conectada a combinador láser principal | |
| Unidad láser simple | 445 nm: 75 mW, 514 nm: 40 mW, o 594 nm: 20 mW, directamente conectada a combinador láser principal | ||
| Control de luz láser |
Combinador láser principal con sistema AOTF implementado; modulación de intensidad ultra rápida con líneas láser individuales; control de obturador adicional continuamente variable (de 0,1 % a 100 %, en incrementos de 0,1 %)
Cambiador de alimentación láser máxima de 10 % o 100 % mediante filtro ND | ||
| Escáner | Método de escaneo | 2 Espejos revestidos en plata para el escaneo galvanométrico |
2 Espejos revestidos en plata para el escaneo galvanométrico
1 espejo revestido en plata para el escaneo resonante y 1 espejo revestido en plata para el escaneo galvanométrico |
|
Escáner galvanométrico
(Imagen normal) |
Resolución de escaneo: de 64 x 64 a 4096 x 4096 píxeles
Velocidad de escaneo (unidireccional): 512 x 512 con tiempo de pixelación de 1.1 s a 264 s.: 2 µs - 1000 µs Velocidad de escaneo (trayectoria ida y vuelta): 512 x 512 con 63 ms - 250 ms, 256 x 256 con 16 ms - 125 ms Zoom óptico: de 1X a 50X en incrementos de 0,01X Rotación de escaneo: rotación libre (360 grados) en pasos de 0,1 grados Modo de escaneo: PT, XT, XZ, XY, XZT, XYT, XYZ, XYλ, XYZT, XYλT, XYλZ, XYλZT Escaneo de área de interés (ROI), clip rectangular, elipse, polígono, área libre, línea y punto libres, modo tornado solo para estimulación | ||
|
Escáner resonante
(Imagen de alta velocidad) | - |
Resolución de escaneo: de 512 x 32 a 512 x 512 píxeles
Velocidad de escaneo: 30 fps a 512 x 512, 438 fps a 512 x 32 Zoom óptico: de 1X a 8X en incrementos de 0,01X Modo de escaneo: XT, XZ, XY, XZT, XYT, XYZ, XYλ, XYZT, XYλT, XYZ, XYλZT Escaneo de área de interés: clip rectangular, línea | |
| Diagrama («Pinhole») | Diagrama («Pinhole») motorizado simple; diámetro de pinhole de ø50 a 800 µm (en incrementos de 1 µm) | ||
| Número de campo (FN) | 18 | ||
| Torreta de espejo dicromático | 8 posiciones (espejos dicroicos de alto rendimiento y espejo 10/90) | ||
| Unidad opcional para escáner | Controlador de alimentación láser; puerto láser opcional | ||
|
Detector espectral
de alta sensibilidad | Módulo de detector | Fotomultiplicador GaAsP refrigerante de 2 canales | |
| Método espectral |
Red de difracción motorizada por transmisión holográfica de fase volumétrica; ranura ajustable motorizada;
ancho de banda seleccionable de longitud de onda: de 1 a 100 nm; resolución de longitud de onda: 2 nm | ||
| Torreta de espejo dicromático | 8 posiciones (espejos dicroicos de alto rendimiento y espejo ***) | ||
| Detector espectral | Módulo de detector | Fotomultiplicador multialcalino de 2 canales | |
| Método espectral |
Red de difracción motorizada por transmisión holográfica de fase volumétrica; ranura ajustable motorizada
ancho de banda seleccionable de longitud de onda: de 1 a 100 nm; resolución de longitud de onda: 2 nm | ||
| Torreta de espejo dicromático | 8 posiciones (espejos dicroicos de alto rendimiento y espejo ***) | ||
| Control del sistema | Unidad de control/mando |
Sistema operativo: Windows 7 Professional de 64 bits (idioma inglés); Windows 10 Professional de 64 bits
en configuración de plataforma I/F y secuenciador de instrumentación para sincronizar de manera precisa la captura de imágenes | |
| Pantalla | Monitor de 30 o 32 pulgadas (WQUXGA 2560 x 1600) | ||
| Unidad de iluminación fluorescente | Fuente de luz fluorescente externa, adaptador de fibra para puerto óptico de escáner, conmutación motorizada entre trayectoria de luz LSM e iluminación fluorescente | ||
| Detector de luz transmitida | Módulo con detector fotomultiplicador integrado de luz transmitida externa y lámpara LED, conmutación motorizada | ||
| Estativo invertido | Estivo vertical (para tratamiento de imágenes) | Estivo vertical (para electrofisiología) | ||||||
| Estativo del microscopio |
Microscopio invertido motorizado
IX83 (IX83P2ZF) |
Microscopio vertical con platina fija motorizada
BX63L |
Microscopio vertical con platina fija motorizada
BX63L | |||||
| Portaobjetivos giratorio | Portaobjetivos giratorio motorizado séxtuple | Portaobjetivos giratorio motorizado séptuple |
Portaobjetivos rebatible codificado
Portaobjetivos deslizante codificado | |||||
| Condensador | Condensador motorizado de distancia de trabajo intermedia | Condensador universal motorizado | Condensador manual de distancia de trabajo larga | |||||
| Carrera de enfoque |
Enfoque de portaobjetivos motorizado integrado
Carrera: incremento mínimo: 0,01 μm | |||||||
| Características básicas |
Interfaz de usuario para ambientes oscuros. Diseños de pantalla personalizables
Características recargadas para los parámetros de adquisición Capacidad de grabación de disco duro, ajuste de alimentación láser y HV con adquisición en pila de Z. Adquisición en pila de Z con mezcla alfa, proyección de intensidad máxima, representaciones de isosuperficies. | |
|---|---|---|
| Visualización de imagen 2D | Para la visualización de cada imagen existen las siguientes características: unicanal de lado a lado, fusión, recorte, mosaico en vivo, series (Z/T/λ), LUT (tabla de consulta cromática) con configuración de color individual, pseudocolor y comentarios (texto o notas gráficas) | |
| Visualización 3D y observación |
Representación volumétrica interactiva: visualización de representación volumétrica, proyección, animación.
Animación 3D (método de proyección de máxima intensidad, α-mezcla), función de operación secuencial 3D y 2D. | |
| Formato de imagen |
Formato de imagen OIR
Escala de grises 8/16 bits - color de clasificación; color en bits de 24/ 32/ 48 - formato de imágenes en JPEG/ BMP/ TIFF, formato multi TIF de Olympus. | |
| Separación espectral | Modos de separación espectral por fluorescencia (hasta 16 canales) | |
| Análisis de imágenes | Medidas de región y línea, gráfico de intensidad en función de tiempo/Z, análisis de colocalización | |
| Procesamiento estadístico | Visualización de histograma de datos 2D | |
| Software opcional |
Control de platina motorizada
| |
Varios procesos biológicos pueden ser capturados en fotogramas por segundo o mediante grabaciones de imágenes más rápidas. El sistema FV3000RS permite adquirir imágenes de procesos altamente dinámicos, como por ejemplo las fluctuaciones del ion calcio, las rápidas contracciones musculares, el seguimiento de pólipos vesiculares y el torrente sanguíneo. Los escaneos de alta velocidad reducen el fotoblanqueo y la fototocixidad mediante la reducción del tiempo de iluminación por área (flujo de fotones) por debajo del tiempo de relajación del estado triplete oscuro, lo cual permite una observación extendida de las células y tejidos vivos. El sistema FV3000RS mantiene un campo de visión completo de 1X en 30 ftp con número de campo 18 para proporcionar un contexto más amplio para rápidos procesos biológicos.
Visualización de tabla de consulta espectral de FRET de un miocito cardíaco; visualización de tabla de consulta espectral de CFP de un miocito cardíaco; observación de contraste de interferencia diferencial (DIC) de un miocito cardíaco; superposición; imágenes de proporción en IMD de la oscilación espontánea de Ca2+ en un latido de cardiomiocito normal expresado en camaleón amarillo. | |
Movimiento rápido de endosomas observados en un desarrollo embrionario de Drosophila.
| |
Plaquetas vinculadas a la trombosis en el torrente sanguíneo del ratón. Imágenes completas, capturadas en 30 fps con el escáner resonante, dotado de módulos fotomultiplicadores (PMT) con semiconductores GaAsP de 2 canales. Dr. Takuya Hiratsuka, Dr. Michiyuki Matsuda, Facultad de posgrados en Biología, Universidad de Kioto. | |
Imagen 3D en intervalos de un fibroblasto embrionario de ratón marcado con docetaxel de rodamina siliconada (tubulina, blanco) y centrina-RFP (verde) obtenida gracias a un objetivo en silicona de 100X y un escaneo resonante en 30 fps mediante la función de deconvolución del software cellSens. Dr. Markus Delling, Universidad de Harvard. | |
Fibroblasto embrionario de ratón con docetaxel de rodamina siliconada (tubulina); observado gracias a un objetivo en silicona de 100X; escaneo resonante con representación de tipo mosaico. Áreas 6 x 6 en cuatro dimensiones XYZT Cortesía de Dr. Markus Delling, Universidad de Harvard. | |
Daphnia representada en detección de transmisión en 30 fps. |
Tecnología de detección TruSpectral multicanal con separación de 16 canales
El eficiente modelo del software que integra la tecnología TruSpectral permite que los detectores espectrales se ejecuten en modo de secuencia; ya sea, para la separación espectral en vivo o postratamiento con un modo multicanal de configuración lambda. El modo multicanal facilita la separación espectral constante en experimentos de células vivas mediante la separación de fluorescencia compleja durante la adquisición. Incluso las señales espectrales brillantes y tenues, provenientes de 4 diferentes rangos dinámicos a partir de los 4 diferentes canales de una secuencia, pueden ser separadas mediante el ajuste de la sensibilidad en cada detector de forma independiente.
Transfección con vector AAV observada por arco iris neural en células de Purkinje con anticuerpos, tal y como se describe en Cai et al., 2013. Se observa pericariones (somas), dendritas y neuritas en células de Purkinje y, también, algunas tinciones no específicas de células granulosas. | |
Imagen en vivo antes de separación por CFP (endosomas, azul), mAmetrine (membrana plasmática, verde), mKO (núcleo, naranja) y mKeima (actina F, morado) durante el tratamiento de imagen en intervalos. Imagen por cortesía del Dr. Kazuhiro Aoki y del Dr. Michiyuki Matsuda, Facultad de posgrados en medicina, Universidad de Kioto. | |
Imagen borrosa separada en vivo. Datos de imagen por cortesía del Dr. Kazuhiro Aoki y del Dr. Michiyuki Matsuda, Facultad de posgrados en Medicina, Universidad de Kioto. | |
Imagen producida por deconvolución espectral a partir de un apilamiento de imágenes de configuración lambda de 9 canales. | |
Adquisición espectral sin tratamiento. |
Los sistemas confocales tradicionales se enfocaban únicamente en el tratamiento de imágenes a nivel micro. Sin embargo, los biólogos también requieren llevar a cabo observaciones de gran aumento en el caso de tejidos más grandes y organismos completos. El microscopio FV3000 permite un tratamiento de imagen macrométrico a partir de 1,25X manteniendo, al mismo tiempo, las capacidades de alta resolución que ofrecen un aumento de hasta 150X. Las imágenes con un aumento bajo aceleran el flujo de trabajo en el caso de una amplia visión de las muestras, y ayudan a eliminar los defectos originados por la mezcla de imágenes debido a la aplicación de la función mosaico u otros factores.
| Riñón de ratón preparado por el Dr. Mike Davidson — imágenes mostradas con eterna gratitud por el compromiso que ha demostrado a la ciencia y la microscopía a través de su vida. | |
Hemisección cerebral de ratón incrustada para microscopía de expansión (expansión preliminar). Marcas de anticuerpos secundarios contra proteína GFP (Alexa Fluor 488 para las neuronas), SV2 (Alexa Fluor 565 en rojo), Homer (Alexa Fluor 647 en azul).
Muestra por cortesía del Dr. Ed Boyden y del Dr. Fei Chen, MIT. | |
Imagen de tipo mosaico 2 × 2 de un embrión completo de rata en campo de visión total de 20 mm. Fluorescencia por hematoxilina y eosina con diodo láser de 640 nm. |
Tratamiento multidimensional de imágenes en intervalos con excelente precisión de posición
El FV3000 puede ser usado para tratar imágenes multidimensionales en intervalos durante la observación confocal con un software de intervalos para múltiples áreas con el fin de controlar la platina XY motorizada y el compensador de deriva en Z.
Rendimiento incrementado de imágenes en intervalos de múltiples puntos
Una platina XY motorizada facilita la adquisición repetida de imágenes a partir de múltiples puntos dispersos a lo largo de una amplia área. El sistema analiza eficientemente cambios en las células en función del tiempo y reúne grandes cantidades de datos durante un experimento para aumentar la eficiencia analítica. Es posible usar microplacas para ejecutar experimentos en paralelo que aumentarán significativamente el rendimiento experimental cuando se requiere períodos de observación prolongados.
Adquisición repetida de imágenes soportada a partir de múltiples áreas en un pocillo de microplaca.
Visualización de vascularización pancreática después de fijación de base PFA y tratamiento de clarificación SCALEVIEW-A2
Vasos sanguíneos marcados con lectina Texas Red® por perfusión transcardíaca. Imagen obtenida con un objetivo UPLSAPO30XS . Tamaño de imagen 425 um × 436 µm (616 × 633 pixeles) Z: 438 µm (219 láminas).
Imagen por cortesía de:
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Aumento de alto nivel y alta resolución para visualizar imágenes adquiridas de muestras de gran volumen
Imagen de tipo mosaico de una incisión coronal (grosor de capa de 30 μm) del cerebro de un ratón adulto YFP-H, adquirida mediante un objetivo de 20X (UPLSAPO20X).
Takako Kogure y Atsushi Miyawaki, «Cell Function Dynamics», Instituto de ciencias neurológicas RIKEN. (7, página 3)
Adquisición automática de imágenes 3D y aplicación mosaico
La herramienta software para múltiples áreas en intervalos automatiza el tratamiento desde la adquisición de imágenes 3D (con la platina XY motorizada) hasta la aplicación mosaico. El software puede ser usado para registrar grandes áreas; la visualización de imágenes en miniatura proporciona una visión completa de las imágenes adquiridas durante el tratamiento de imágenes mosaico.
Imágenes de múltiples puntos y de tipo mosaico
Gracias a la platina XY motorizada, la función mosaico permite recoger múltiples imágenes para crear una gran imagen de la muestra. Esta imagen se obtiene a partir de imágenes adquiridas de múltiples puntos de una sección del cerebro de un ratón (YFP) que, posteriormente, son unidas.
Modos de representación de imagen seleccionables
Representación volumétrica interactiva
Uso del software de representación volumétrica interactiva con visualización 3D; el ángulo de una representación 3D puede ser orientado a la dirección deseada al mover el ratón. Existe una variedad de funciones de visualización que incluyen: enfoque de imagen ampliado y visualización transversal de cualquier área de la representación volumétrica.
Creación de animaciones en 4D
| Es posible aplicar una animación en 4 dimensiones (XYZT) a las estructuras tridimensionales que cambian en función del tiempo provenientes de imágenes adquiridas. |
Compensación de brillo para imágenes en profundidad
Al adquirir imágenes en tercera dimensión, estas pueden resultar oscuras si la captura de imagen se realiza de forma más profunda en el tejido. El microscopio FV3000 cuenta con una función que incrementa la intensidad láser o sensibilidad PMT mientras la captura de imagen se realiza de forma más profunda con el fin de mantener un brillo uniforme a través del plano Z.
Se ofrece una amplia gama de funciones para analizar imágenes en tiempo real o posteriormente con el fin de incrementar la producción de datos:
Funciones de tratamiento de imagen y análisis del software cellSens. Por favor, haga clic en el enlace a continuación para consultar la lista completa de las funciones cellSens.
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Haga clic en este enlace para obtener más información acerca de las funciones del software cellSens
Existe una amplia variedad de modos que se aplican a los escaneos resonantes y galvanométricos. Por favor, consulte la pestaña de Especificaciones para obtener más detalles.
Escaneo resonante
El escaneo resonante permite adquirir datos a alta velocidad, mejorar las mediciones dinámicas y reducir el fotoblanqueo y fototoxicidad en un amplio campo de visión. El sistema FV3000RS cuenta con la velocidad para capturar imágenes dinámicas obtenidas mediante un escaneo de campo de visión completo de 1X con 30 fotogramas/seg.; un escaneo de clips de hasta 438 fotogramas/seg., o un escaneo lineal de hasta 7,87kHz.
Escaneo galvanométrico
El escaneo galvanométrico proporciona alta precisión, una excelente relación entre señal y ruido, y una variedad incrementada de trayectorias de escaneo y capacidades de estimulación. El escáner galvanométrico de la serie FV3000 también cuenta con un modo de escaneo entrelazado capaz de generar 16 fotogramas por segundo con un factor de aumento de tan solo 2X.
Diagrama en vivo
Los cambios de intensidad fluorescente que se dan en un área de interés son representados gráficamente en tiempo real durante la adquisición de imágenes.
Modo mosaico en vivo con revisión
Esta función permite que el usuario controle las imágenes adquiridas durante un experimento en intervalos. Durante el tiempo de reposo, es posible ajustar el enfoque o brillo de la imagen.
Disparador
El sistema también cuenta con un disparador para sincronizar los escaneos con dispositivos externos. El escaneo puede ser iniciado o detenido mediante una señal emitida por el disparador; además, es posible usar un disparador externo para la adquisición de cada fotograma de imagen.
Controlador de potencia del láser opcional
La salida del láser es sometida a una retroalimentación para que la muestra se mantenga siempre expuesta a un nivel fijo de excitación de luz, y la cantidad de fluorescencia pueda ser medida adecuadamente.
Es posible aplicar una rápida fotoestimulación secuencial al usar un escáner galvanométrico con un valor de retardo de tan solo 100 ms. Existen aplicaciones, como la recuperación de fluorescencia posterior al fotoblanqueo (FRAP), la pérdida de fluorescencia inducida por fotoblanqueo (FLIP) y la fotoconversión en áreas complejas que pueden ser ejecutadas en muestras vivas.
Fotoconversión (proteína Kaede)
La Kaede es una proteína fotoconvertible fluorescente especializada que puede cambiar de color por irradiación de luz y se dota de una longitud de onda específica. Cuando la proteína Kaede es expuesta a la luz láser, su fluorescencia cambia de verde a rojo. Este fenómeno puede ser usado para marcar células individuales que expresan Kaede en un grupo de células.
Cuando la proteína Kaede es estimulada por iluminación láser ultravioleta, su color verde cambia a rojo tal como lo hace un arce en otoño («Kaede» significa «arce» en japonés). La difusión del color rojizo de la proteína Kaede puede ser controlada en toda el área de la célula, lo cual proporciona un método preciso para marcar la célula completa.
Las células gliales (astroglías) de expresión Kaede se encuentran apiladas en neuronas de expresión Kaede. Al iluminar dos colonias celulares con un láser de 405 nm, la proteína Kaede verde fluorescente puede convertirse irreversiblemente a rojo. Las células gliales en contacto con las neuronas son observadas mientras forman colonias y extienden sus procesos; también, el núcleo de dichas colonias puede ser observado.
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