De la première observation par Robert Hooke, au moyen de son objectif maison, de cellules cloisonnées en forme de cube jusqu’aux recherches d’Osamu Shimomura sur l’équorine et la GFP de méduse, en passant par les nouvelles molécules de fluorophore clignotant de Xiaowei Zhuang lors de la reconstruction en super-résolution 3D, nous n’avons jamais cessé d’explorer les microcosmes du vivant au moyen de la microscopie optique.

En tant que pilier de la quatrième révolution industrielle, l’ingénierie des nanotechnologies s’est imposée au XXI^e siècle, au départ dans les applications de la science des matériaux. Lorsque les nanotechnologies sont entrées en collision avec les sciences de la vie, elles ont produit une nouvelle étincelle, les nanosondes fluorescentes, qui éclairent le microcosme du vivant à la lumière des nanomatériaux.

L’aube de la microscopie de fluorescence

La fluorescence est un type de photoluminescence causée par l’absorption de lumière. Il existe de nombreux phénomènes fluorescents dans la nature. La protéine fluorescente verte (GFP) extraite de méduses luminescentes a été la première application pratique de ce phénomène pour explorer le monde microscopique vivant. Au début des années 90, les chercheurs ont découvert que l’introduction du gène de la GFP dans d’autres organismes vivants pour y exprimer la GFP entraînait la production d’une fluorescence verte chez des organismes qui n’émettent pas naturellement de fluorescence. Depuis lors, les scientifiques ont amélioré les couleurs disponibles, l’intensité lumineuse, la stabilité et d’autres propriétés de la GFP en analysant sa structure et ses mécanismes, ce qui a considérablement fait progresser le développement et l’utilisation de protéines fluorescentes (PF) en bio-imagerie (figure 1).

Figure 1 – Imagerie de fluorescence multicolore d’un intestin postérieur d’une larve de drosophile, où le jaune marque la f-actine et le vert les noyaux, et où les gouttelettes lipidiques sont révélées par application d’une table de correspondance intensitométrique (LUT)

Bien que la famille des protéines fluorescentes ne cesse de s’agrandir, son champ d’application reste limité. Le spectre d’émission des protéines fluorescentes est large et asymétrique, ce qui se traduit par de fréquentes interférences en imagerie multicanal simultanée. Avec l’aide de la synthèse chimique, des fluorophores organiques très variés et simples à utiliser ont émergé, venant non seulement élargir considérablement le champ d’application de l’imagerie de fluorescence, mais également faciliter la production commerciale standardisée, ce qui a jeté les bases d’un véritable bond dans le développement.

Les nanomatériaux font faire des progrès à la bio-imagerie

Peu à peu, certains inconvénients des fluorophores organiques, comme un faible rendement de fluorescence et une faible photostabilité, sont apparus comme autant d’obstacles aux progrès de l’imagerie de fluorescence. Heureusement, en raison de propriétés optiques spéciales inhérentes, de la synthèse et de l’assemblage dirigés ainsi que d’autres atouts, les nanomatériaux injectent du sang neuf dans l’imagerie de fluorescence. À l’heure actuelle, on compte parmi les nanomatériaux fluorescents courants les nanomatériaux suivants (figure 2) :

• Boîtes quantiques semi-conductrices
• Matériaux de terres rares à conversion ascendante (nanoparticules à conversion ascendante, UCNP en anglais)
• Nanoparticules de métaux nobles

Par rapport à d’autres fluorophores, les nanomatériaux fluorescents offrent les avantages d’un rendement quantique élevé, d’une grande stabilité, d’un grand déplacement de Stokes, d’un large spectre d’excitation et d’un spectre d’émission étroit. Leurs longueurs d’onde d’émission peuvent être modifiées en ajustant leur taille. Leur biocompatibilité et leurs fonctions de reconnaissance et de détection peuvent être améliorées par assemblage et introduction de modifications. Les nanomatériaux offrent donc un excellent potentiel pour le marquage fluorescent ainsi que pour l’avenir de l’imagerie de fluorescence.

Figure 2 – Exemples de nanoparticules organiques et inorganiques, avec leur taille, leur forme et les matériaux qui les composent

Les grandes étapes de l’ingénierie des nanosondes fluorescentes

Étant donné qu’il s’agit d’un processus interdisciplinaire impliquant la nanochimie et la bio-imagerie, le processus d’ingénierie des nanosondes fluorescentes diffère de celui de la bio-imagerie traditionnelle. Il s’agit d’un processus en plusieurs étapes comprenant le calcul théorique, la synthèse chimique, la bio-imagerie et même des tests médicaux (figure 3).

Figure 3 – Les grandes étapes de l’ingénierie des nanosondes fluorescentes

Les processus de recherche utilisant des nanosondes fluorescentes sont principalement axés sur l’application pour laquelle les sondes sont destinées. L’utilisation de la bio-imagerie recourant à des nanosondes fluorescentes s’étend de l’observation d’échantillons in vitro à l’imagerie dynamique in vivo et peut même être envisagée dans les examens et les diagnostics médicaux. Par conséquent, la conception de la nanosonde tient compte de l’application biologique envisagée ; des nanomatériaux ayant des propriétés optiques spéciales ou d’autres fonctions (par exemple, proche infrarouge, conversion ascendante, biphotonique, etc.) sont choisis en fonction des besoins spécifiques des applications biologiques, puis ils sont synthétisés et caractérisés pour sélectionner les nanomatériaux de plus grande qualité. Par la suite, les sondes sont modifiées et assemblées (figure 4) en tenant compte de leur biocompatibilité ou des besoins de leurs fonctions, comme la manipulation optique, le chargement de médicaments, la reconnaissance moléculaire, etc.

Figure 4 – Représentation 3D de nanosondes d’or (GNP) fonctionnalisées recouvertes
de molécules de protéine fluorescente verte (GFP) et d’acide citrique

Dans le cadre de travaux de recherche impliquant des nanosondes fluorescentes, la microscopie optique est principalement utilisée dans trois domaines : le criblage de nanomatériaux de haute qualité, leur caractérisation et la détection in vivo des nanosondes. Dans le processus de criblage, les caractéristiques des différentes particules sont souvent très variables en raison de l’hétérogénéité structurale inhérente aux particules. Contrairement aux méthodes classiques qui s’appuient sur les caractéristiques d’ensemble d’un grand nombre de particules, la microscopie optique permet le criblage de sondes de haute qualité au niveau d’une particule individuelle et une étude plus approfondie des relations entre structure et fonction pour guider leur synthèse. En bio-imagerie, la microscopie optique permet la détection in vivo des signaux optiques des nanosondes pour prendre des images de leurs réactions spatiotemporelles dynamiques et les suivre.
 

Applications des nanosondes fluorescentes et solutions de microscopie pour la recherche

Imagerie proche infrarouge/par conversion ascendante à l’aide d’un microscope confocal

L’imagerie proche infrarouge a actuellement le vent en poupe en microscopie optique grâce à sa capacité de pénétration profonde, à sa faible phototoxicité et à la faible interférence de l’autofluorescence des tissus. Les nanosondes fluorescentes, comme les boîtes quantiques, peuvent facilement atteindre l’excitation dans le proche infrarouge (NIR) en faisant l’objet d’ajustements quant à leur composition chimique, leur structure et leur taille. En outre, les nanomatériaux à conversion ascendante ont une propriété optique spéciale qui se révèle pratique pour l’imagerie NIR. Ils émettent de la lumière de longueur d’onde plus courte (dans le visible ou l’ultraviolet) que celle de la lumière d’excitation lorsqu’ils sont excités par une lumière de grande longueur d’onde (NIR). En raison de ces avantages, les nanosondes à conversion ascendante sont considérées comme des biomarqueurs fluorescents de nouvelle génération et devraient jouer un rôle important dans la biomédecine, la recherche sur l’énergie et la catalyse, entre autres domaines.

Une détection in vivo sensible et en temps réel de l’hépatotoxicité constitue actuellement un goulot d’étranglement dans le diagnostic des lésions hépatiques induites par les médicaments. Lors de travaux publiés en 2020 par le groupe de recherche du professeur Li Huijun, une nanosonde à conversion ascendante a été conçue par assemblage de nanoparticules à conversion ascendante (UCNP) et de nanotiges d’or (GNR) et a été utilisée pour le diagnostic in situ en temps réel des lésions hépatiques induites par les médicaments. Cette nouvelle nanosonde peut s’agréger dans le foie et être activée spécifiquement par un marqueur de lésion hépatique, miR122, pour produire des images de fluorescence à 800 nm lorsqu’elle est excitée par une lumière proche infrarouge à 980 nm. En combinaison avec la technologie LRET (transfert d’énergie de luminescence par résonance) et la technologie d’amplification du signal, sa sensibilité de détection est encore augmentée pour atteindre une détection hautement sensible de miR122, ce qui permet une nouvelle approche en matière de surveillance clinique en temps réel des lésions hépatiques induites par les médicaments [4].

Contrairement à l’imagerie confocale conventionnelle, l’imagerie des nanosondes NIR/à conversion ascendante nécessite un équipement doté de certaines fonctionnalités :

• Les longueurs d’onde d’excitation couramment employées en microscopie confocale conventionnelle sont de l’ordre de 400 à 650 nm, alors que l’imagerie proche infrarouge nécessite des lasers NIR utilisant des longueurs d’onde de plus de 700 nm.
• La plupart des composants du trajet optique utilisés dans l’imagerie conventionnelle, comme le galvanomètre à balayage, les objectifs et les réseaux de diffraction, n’assurent les fonctions d’antireflet/de correction que dans le visible et ne peuvent pas fournir l’efficacité et la précision nécessaires pour l’imagerie NIR.
• La détection du NIR nécessite des détecteurs dédiés de NIR de plus de 750 nm.

Pour satisfaire à ces exigences, le microscope confocal laser FLUOVIEW™ FV4000 offre une solution d’imagerie NIR (figure 5). Le système FV4000 se spécialise en imagerie proche infrarouge hautement sensible et fiable, avec plus de couleurs.
 

Système FV4000 avec imagerie proche infrarouge Laser proche infrarouge : laser à l’état solide à haute puissance 685/730/785 nm Optimisation des composants optiques pour le proche infrarouge : revêtement pour proche infrarouge jusqu’à 1600 nm, scanner galvanométrique à revêtement d’argent Objectifs X Line™ : correction des aberrations chromatiques de 400 à 1000 nm, précision améliorée et plus de couleurs Détecteurs de proche infrarouge dédiés : détecteur SilVIR™, longueur d’onde de réponse jusqu’à ~900 nm

Figure 5 – Le système confocal à balayage laser FLUOVIEW FV4000 modulaire offre une solution d’imagerie proche infrarouge

Dans cette note d’application préparée en collaboration avec le D^r Kai Li (Southern University of Science and Technology, Chine), vous en apprendrez plus sur l’utilisation concluante de la solution proche infrarouge FLUOVIEW pour la détermination de la capacité de ciblage de la molécule de fluorescence proche infrarouge, à savoir les nanoparticules basées sur la nanosonde BTB, des cellules tumorales (figure 6). Les chercheurs de cette étude ont modifié la surface de la nanosonde BTB avec le peptide ciblant Arg-Gly-Asp (RGD) et ont observé que durant 48 heures, la souris à laquelle ils avaient injecté les nanosondes fluorescentes BTB-RGD présentait une augmentation significative du signal de fluorescence NIR-II au site de la tumeur par rapport à la nanosonde BTB sans peptide ciblant.

Figure 6 – Images confocales de cellules 3T3, PC3 et U87 acquises avec FV3000 Red
après incubation avec 40 μg/mL-1 de nanoparticules BTB-RGD ou BTB pendant 4 heures.
Longueur d’onde d’excitation : 730 nm, filtre : 760 - 890 nm, échelle graphique = 50 µm
 

Imagerie in vivo de marqueurs tumoraux à l’aide de la solution de détection en profondeur du microscope multiphotonique FLUOVIEW

Le cancer est l’une des préoccupations majeures en matière de santé publique de nos sociétés modernes. Pouvoir établir un diagnostic précoce et pratiquer une excision précise des tumeurs malignes est l’une des priorités majeures de la recherche médicale actuelle. La conception et le développement de nouvelles nanosondes fluorescentes pour l’identification spécifique des marqueurs tumoraux et l’imagerie in vivo à haute résolution peuvent fournir de nouvelles solutions de détection pour le diagnostic clinique précoce des tumeurs malignes ainsi que pour la précision de leur excision chirurgicale.

La surexpression d’enzymes, comme les phosphatases alcalines (PAL), dans les cellules tumorales est un indicateur clinique important de la genèse, du développement et de la progression des tumeurs. Par conséquent, une méthode de détection rapide avec une haute sensibilité à l’activité des PAL peut permettre la détection précoce et l’excision précise des tumeurs. En 2020, le Professeur Xiaojun Peng et son équipe ont publié un article sur l’utilisation d’une nanosonde conçue à cet effet. L’article détaille comment ils ont conçu et préparé une sonde AIEgen (DQM-ALP) qui émet une forte fluorescence lors de son agrégation après interaction avec les PAL surexprimées dans les cellules tumorales. Cette nanosonde spécialement conçue permet d’éviter le problème de désactivation de la fluorescence causé par l’agrégation des fluorophores organiques classiques et d’augmenter ainsi la sensibilité de la détection et le temps de rétention de la sonde dans les cellules tumorales. Ce travail a permis pour la première fois de mettre en évidence la régulation à la hausse de l’activité des PAL dans les cellules tumorales entraînée par une stimulation au butyrate de sodium et au cortisol. La microscopie photonique à deux photons a été utilisée pour produire des images en profondeur tridimensionnelles à haute résolution spatiale de l’activité des PAL dans des sphéroïdes tumoraux HeLa et HepG-2. Les auteurs ont démontré l’utilité de la sonde dans l’imagerie de détection par fluorescence des tumeurs submillimétriques, cette sonde constituant un auxiliaire puissant pour le diagnostic clinique et l’excision chirurgicale des tumeurs [5].

Des microscopes confocaux à un et deux photons ont été utilisés dans cette étude. Cependant, le dernier microscope multiphotonique FLUOVIEW, conçu pour l’imagerie de fluorescence en profondeur in vivo avec un scanner galvanométrique résonant exclusif à grande vitesse et un trajet de détection optique très sensible, peut produire des images 3D en profondeur à haute résolution des marqueurs tumoraux de façon plus précise et plus efficace (figure 7).

En combinant des lasers doubles/double ligne et une capacité de détection à haute sensibilité sur jusqu’à six canaux, le système multiphotonique Evident permet une imagerie multicolore plus flexible, pour un meilleur rendement et une meilleure efficacité de détection.
 

Système multiphotonique FV4000MPE Excitation infrarouge efficace : composants optiques à revêtement pour l’infrarouge jusqu’à 1600 nm Observation en profondeur : objectif spécialement conçu pour l’imagerie à des profondeurs allant jusqu’à 8 mm Acquisition ultrarapide d’images à haute résolution : scanner résonnant 1 × 1K à FN20 avec 0,033 µs par pixel Imagerie multiphotonique multicolore : deux lasers + détection multiphotonique à 6 canaux

Figure 7 – Système multiphotonique FV4000MPE avec des modules pour l’imagerie en profondeur

Détection dynamique des nanosondes dans les cellules vivantes à l’aide de la solution d’imagerie rapide à super-résolution IXplore™ SpinSR

Dans les cellules vivantes, les réactions biochimiques et autres événements moléculaires ont souvent des caractéristiques dynamiques spatiotemporelles importantes. La technologie d’imagerie optique permet de suivre avec précision le mouvement des nanosondes et d’étudier leurs interactions avec les biomolécules. Elle permet aux chercheurs de surveiller efficacement ces biomarqueurs afin d’observer les changements dynamiques et explorer plus avant les relations entre leurs états et les fonctions cellulaires associées. Les endosomes, les lysosomes et d’autres organites jouent un rôle clé dans la transduction des signaux et le maintien de l’homéostasie métabolique. Comme le pH de ces organites change au cours de l’endocytose, la détection rapide et sensible des valeurs de pH de ces organites est devenue le centre d’intérêt de la recherche sur la surveillance dynamique du processus d’endocytose et sur l’exploration des relations entre leurs états et leurs fonctions cellulaires.

En 2016, le professeur Yiguang Wang de l’université de Pékin et l’équipe de recherche du professeur Jinming Gao du Southwestern Medical Center de l’université du Texas ont publié un article dans lequel ils décrivent la conception d’une nanosonde de pH ultrasensible (HyUPS) à résolution mono-organite. Ils ont utilisé cette nanosonde pour suivre et détecter les changements de pH dans les endosomes/lysosomes et autres organites pendant l’endocytose. La sonde comprend trois composants sensibles au pH correspondant aux trois composantes de l’endocytose et à trois plages de pH, qui sont marqués, respectivement, par des fluorophores rouges, verts et bleus. La sonde a permis de réaliser un suivi dynamique en temps réel et multicolore du taux d’acidification des organites impliqués dans l’endocytose des cellules vivantes et constitue un nouvel outil d’imagerie pour d’autres études sur les maladies endosomales/lysosomales [6].

L’imagerie de nanosondes dans un échantillon vivant nécessite un équipement d’imagerie à grande vitesse, mais l’approche confocale à balayage par points conventionnelle ne répond pas à ces exigences. Le système d’imagerie confocale à super-résolution à disque rotatif IXplore SpinSR permet de réaliser de l’imagerie multicolore rapide (200 i/s) en super-résolution (110 nm) [figure 8]. Ces capacités lui permettent de capter les processus dynamiques rapides des structures fines, ce qui en fait un outil puissant permettant aux chercheurs en sciences de la vie d’améliorer facilement l’efficacité de leur imagerie. Le RTCe (contrôleur en temps réel) exclusif contrôle le fonctionnement synchronisé de tous les composants afin de minimiser l’impact de la lumière d’excitation sur les échantillons. Cet avantage, associé à des objectifs à huile de silicone conçus pour la biopsie profonde, permet une imagerie en profondeur précise et sur une longue durée des cellules, des sphéroïdes et des organoïdes vivants.

Un exemple des capacités d’imagerie à super-résolution du système IXplore SpinSR montrant les mitochondries des cellules épithéliales marquées au PKMDR (PK Mito Deep Red) se trouve à la figure 9. Développé par le Professeur Zhixing Chen de l’université de Pékin, le PKMDR est une sonde mitochondriale qui minimise la phototoxicité en imagerie de fluorescence et nanoscopique.
 

Système confocal à disque rotatif Xplore SpinSR Super-résolution de 110 nm Grande vitesse, 200 images par seconde Imagerie à faible phototoxicité pour les cellules vivantes
Figure 8 – Système d’imagerie confocale à super-résolution à disque rotatif IXplore SpinSR

Figure 9 – Image en super-résolution des mitochondries des cellules épithéliales marquées au PKMDR
prise à l’aide du système IXplore SpinSR, de l’objectif UPLAPO60XOHR et du traitement TruSight™.
Image reproduite avec l’aimable autorisation de la D^re Huiwen Hao et du D^r Junsheng Yang, et des Professeurs Yujie Sun et Zhixing Chen.
Standard Imaging Co., Ltd. et Sun Lab, College of Future Technology, PKU. NanJing GenVivo Biotech Co., Ltd.
 

Au cours de la dernière décennie, avec le développement rapide des nanotechnologies et des technologies d’imagerie optique, de nombreux progrès importants ont été réalisés dans les applications d’imagerie biochimique à l’aide des nanosondes fluorescentes. Toutefois, l’application des nanosondes fluorescentes est encore limitée par leur biocompatibilité, le clignotement de la fluorescence et d’autres faiblesses. Avec la poursuite du développement et de l’intégration des nanomatériaux et des technologies de bio-imagerie, de la synthèse chimique, de la physique théorique et de l’analyse d’images, on s’attend à ce que la spécificité, la précision, la stabilité et la reproductibilité de la bio-imagerie des nanosondes fluorescentes fassent l’objet d’autres améliorations, ce qui élargira son potentiel pour jouer un rôle plus important dans davantage de domaines de recherche.

* Cet article a été mis à jour à partir du contenu de l’article d’origine publié le 6 octobre 2022.

Références bibliographiques :

[1]. Shu-Lin Liu, Zhi-Gang Wang, Hai-Yan Xie, An-An Liu, Don C. Lamb et Dai-Wen Pang (2020) Single-Virus Tracking: From Imaging Methodologies to Virological Applications. Chemical Reviews 120 (3), 1936-1979. DOI: 10.1021/acs.chemrev.9b00692

[2]. Chang, H., Xie, J., Zhao, B., Liu, B., Xu, S., Ren, N., Xie, X., Huang, L., & Huang, W. (2014). Rare Earth Ion-Doped Upconversion Nanocrystals: Synthesis and Surface Modification. Nanomaterials (Bâle, Suisse), 5(1), 1–25.

[3]. Chen, Z., Wu, X., Hu, S., Hu, P., & Liu, Y. Multicolor upconversion NaLuF4 fluorescent nanoprobe for plant cell imaging and detection of sodium fluorescein. J. Mater. Chem. C, 2015, 3, 153-161

[4]. Meng, L., Zheng, X., Zheng, Z., Zhao, Z., Wang, L., Zhou, P., Xin, G., Li, P., & Li, H. A sensitive upconverting nanoprobe based on signal amplification technology for real-time in situ monitoring of drug-induced liver injury. Nanoscale. 2020 Jul 23;12(28):15325-15335.

[5]. Li, H., Yao, Q., Xu, F., Li, Y., Kim, D., Chung, J., Baek, G., Wu, X., Hillman, P., Lee, E., Ge, H., Fan, J., Wang, J., Nam, S., Peng, X., & Yoon, J., An Activatable AIEgen Probe for High-Fidelity Monitoring of Overexpressed Tumor Enzyme Activity and Its Application to Surgical Tumor Excision. Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 10186.

[6]. Wang, Y., Wang, C., Li, Y., Huang, G., Zhao, T., Ma, X., Wang, Z., Sumer, B.D., White, M.A., Gao, J., Digitization of Endocytic pH by Hybrid Ultra‐pH‐Sensitive Nanoprobes at Single‐Organelle Resolution. Adv.Mater.2017, 29, 1603794.

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